1、胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈不斷上升的越勢，占消化道惡性腫瘤的8％～10％。由于缺乏早期的臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者在確診時已屬晚期，只有約12％～15％可進行根治手術，但術后容易復發(fā)，預后甚差。傳統(tǒng)的化療藥物僅針對癌細胞進行治療，實驗證明，胰腺癌中存在一群數(shù)量極少的腫瘤干細胞，其具有自我更新、多向分化及無限增殖的特性；腫瘤干細胞自我更新的概念是腫瘤干細胞指在增殖過程中，通過不均一分裂，一個CSC(cancer stem cell)可分

2、裂成一個新的CSC和另一個可最終分化為包括腫瘤細胞在內(nèi)的各種細胞的子細胞，使腫瘤能夠維持CSC數(shù)目穩(wěn)定并能不斷產(chǎn)生腫瘤細胞；胰癌干細胞通過自我更新，不斷產(chǎn)生腫瘤細胞，令腫瘤的治療不能將癌細胞徹底殺滅，是導致腫瘤治療效果差、易復發(fā)及預后差的主要原因。 Hedgehog(HH)信號通路是腫瘤干細胞的自我更新機制之一，主要由四部分所組成，包括：HH配體、2個跨膜蛋白質(zhì)受體(PTCH)、(Smo)組成的受體復合物以及下游的轉錄因子Gl

3、i蛋白，通過激活此通路使腫瘤干細胞的自我更新能力增強；cyclopamine(環(huán)巴明)是Hedgehog信號通路的抑制劑，通過作用于Smo蛋白阻止該信號往下傳遞，從而抑制腫瘤干細胞的自我更新。目前國內(nèi)外的研究已證實Hedgehog通路在多種腫瘤中有表達，Hedgehog通路的研究可以為日后針對腫瘤干細胞治療提供更進一步的資料。 腫瘤干細胞自我更新的機制目前認為有以下五點：①Hedgehog信號通路；②Wnt信號途徑；③polyc

4、omb group基因家族；④CSC的微環(huán)境；⑤成纖維生長因子信號。不同種類的或者類型相同的腫瘤在不同的發(fā)展階段中，腫瘤干細胞存在自我更新的信號表達可能有差異，而且，各機制之間也可能存在相互影響。 為了進一步了解胰腺癌干細胞自我更新的特性，在國內(nèi)外研究的基礎上，我們推測胰腺癌干細胞可能存在Hedgehog信號通路，且參與其自我更新的作用，通過cyclopamine阻斷該通路，從細胞增殖、周期及凋亡等方面分析其作用機制，為今后針對

5、胰腺癌干細胞治療的研究作初步探討。 研究目的： 選擇cyclopamine特異性阻斷Hedgehog信號通路，觀察其對胰腺癌干細胞自我更新能力的影響作用及其機制，探討阻斷Hedgehog信號通路對胰腺癌的可能治療作用。 材料和方法： 實驗材料： 細胞系胰腺癌PANC-1細胞由中山大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室提供；永生化胰腺導管上皮細胞H6C7細胞由加拿大安大略癌癥研究所惠贈。胰腺癌PANC-1細

6、胞培養(yǎng)在RPMI1640(含10％胎牛血清)。H6C7細胞培養(yǎng)在K—SFM培養(yǎng)基中。 實驗方法： 1.胰腺癌干細胞的獲得方法：將PANC-1球囊細胞培養(yǎng)方法到第12-15天；PANC-1細胞及H6C7細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時進行實驗； 2.cyclopamine對胰腺癌干細胞自我更新能力的影響作用：WST—8法檢測cyclopamine在不同濃度(0，0.5，1，2，5，10umol/L)及不同時間(24，48，7

7、2h)對細胞自我更新的抑制情況； 3.細胞周期和凋亡檢測采用流式細胞技術，根據(jù)WST—8法檢測結果選取cyclopamine10 umol/L濃度及72h分別處理上述三種細胞，利用流式細胞術檢測加藥前后細胞周期及凋亡的變化。 統(tǒng)計方法： 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。應用SPSS11.0 for windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。顯著性差異水平為P<0.05。

8、 結果： 1.采用懸浮法培養(yǎng)獲得胰腺癌干細胞，傳代。 2.胰腺癌PANC-1球囊細胞經(jīng)5、10umol/L濃度的cyclopamine處理72h后細胞隨著濃度的提高抑制率呈逐漸上升的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學處理后5及10umol/L的濃度具有統(tǒng)計學意義，其抑制率分別為(31.66±5.30)％、(37.85±13.69)％。而24h及48h未見明顯抑制。 3.cyclopamine對胰胰腺癌PANC-1細胞無明顯抑

9、制作用，而對永生化胰腺導管上皮細胞H6C7于10umol/L的濃度處理72h后對細胞增殖有明顯抑制作用，其抑制率為(43.55±28.98)％，具有統(tǒng)計學意義。而24h及48h未見明顯抑制。 4.選取10umol/L濃度的cyclopamine分處理實驗細胞72h后進行細胞周期檢測；胰腺癌PANC-1球囊細胞及胰腺癌PANC-1細胞出現(xiàn)G1期下降，分別占(36.53±6.03)％及(53.13±1.10)％，而對照組G1期分別占

10、(67.41±6.35)％及(67.64±6.88)％，具有統(tǒng)計學意義。永生化胰腺導管上皮細胞H6C7則未見明顯變化(P>0.05)。 5.選取10umol/L濃度的cyclopamine分處理實驗細胞72h后進行細胞凋亡檢測；結果顯示，三種實驗細胞于加藥前后凋亡細胞數(shù)均未見明顯變化(P>0.05)。 結論： 1.胰腺癌PANC-1球囊細胞可能存在Hedgehog信號通路，且與其自我更新密切相關； 2.永