1、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）又被稱為豬皰疹病毒1型或奧耶斯基病病毒，屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬。PRV可引起家畜和多種野生動物發(fā)生偽狂犬病，其中豬是該病的主要宿主和傳染源。PRV在多個國家均有流行，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，造成嚴重的經(jīng)濟損失。PRV DNA復制是一個復雜的過程，需要病毒編碼的多種酶蛋白協(xié)同參與，其中病毒DNA聚合酶發(fā)揮關鍵作用。PRV DNA聚合酶包含2個亞基：催化亞基UL30和輔

2、助亞基UL42。UL30具有天然的酶活性，能催化病毒 DNA的合成，而UL42能將聚合酶全酶固定在DNA模版上，增強全酶的持續(xù)合成能力。PRV DNA聚合酶在細胞質合成后必須轉運到細胞核中才能發(fā)揮功能，這是啟動病毒DNA復制的先決條件。然而，PRV DNA聚合酶入核轉運的分子機制尚未闡明。作為PRV DNA聚合酶的輔助亞基，UL42是否是病毒復制所必需的也還不清楚。本研究旨在闡明PRV DNA聚合酶UL42與UL30亞基入核轉運的分子機

3、制，并明確輔助亞基UL42在PRV DNA復制過程中的作用。
　　為闡明PRV DNA聚合酶UL42與UL30亞基的入核通路，本研究經(jīng)免疫熒光試驗證實，UL42能獨立定位于細胞核中，UL30主要定位于細胞質中，然而當UL42與UL30共表達時，UL30的細胞質定位完全轉移為細胞核定位，表明UL30的入核轉運依賴于UL42。對UL42和UL30進行缺失和定向突變分析發(fā)現(xiàn)，UL42在354～370位氨基酸包含一個功能性和可轉移性的雙分

4、型核定位信號（Nuclear localization signal，NLS），并證實K354、R355和K367是UL42雙分型NLS保持完整結構和功能所必需的，然而UL30并無功能性NLS。免疫共沉淀試驗結果表明，UL42與Importinα3（Impα3）和Impα4存在相互作用，且這一相互作用是由UL42雙分型NLS介導的。經(jīng)體外入核轉運試驗證實，UL42的核定位是一個溫度、能量和受體依賴的過程，需要Impα和Impβ同時參與，

5、表明UL42是經(jīng)Impα/β通路入核的。當缺失NLS的UL42突變體（UL42ΔNLS）與UL30共表達時，UL42ΔNLS/UL30異源二聚體被完全限制在細胞質中，表明UL30利用UL42 NLS的功能入核。上述結果表明，PRV DNA聚合酶全酶復合體在細胞質中裝配完成后，借助于UL42雙分型NLS的功能，經(jīng)Impα/β通路入核。
　　研究表明，PRV UL42能在體外刺激UL30的催化活性，且它是UL30的細胞核協(xié)同轉運蛋白，

6、能在體外引導UL30入核，因此推測UL42是PRV復制的必需基因。本研究對PRV感染后UL42的表達動力學進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)UL42是PRV的一個早期基因，在病毒感染后5 h就能檢測到。根據(jù)UL42序列特征設計了3條特異性siRNAs，經(jīng)Western blot試驗證實它們都能在體外有效地抑制UL42的表達。在哺乳動物細胞中轉染siRNAs后感染PRV，結果發(fā)現(xiàn)這3條siRNAs能劑量依賴性地抑制病毒感染后UL42的表達，且在下調UL