1、研究背景：
　　隨著人們生活水平的提高，我國(guó)居民心血管疾病的發(fā)病率顯著增加。血管內(nèi)皮細(xì)胞是指襯于整個(gè)血管系統(tǒng)內(nèi)表面的單層上皮細(xì)胞，它不但是血管壁與血液的天然屏障，更具有維持循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的功能。重大的心血管疾?。ㄈ绺哐獕?、冠心病等）都與血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控功能障礙和損傷相關(guān)。因此，闡明血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的機(jī)制對(duì)于防治重大心血管疾病具有重要意義。
　　RNA腺苷脫氨酶(Adenosine deaminases that act o

2、n RNA，ADAR)是能將RNA中腺苷酸(Adenosine)轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤核苷(Inosine)的RNA A-Ⅰ編輯酶。ADAR1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有編輯酶活性的脫氨酶之一，它已經(jīng)被證明在胚胎發(fā)育、病毒感染、腫瘤的發(fā)生以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。許多具有重要生理功能的蛋白質(zhì)都受到RNA A-Ⅰ編輯的調(diào)控，但目前關(guān)于ADAR1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制尚不明了。ADAR1基因敲除小鼠胚胎呈白色、血管樣結(jié)構(gòu)減少，提示A

3、DAR1敲除影響小鼠胚胎血管發(fā)育。然而，ADAR1如何影響內(nèi)皮功能缺乏深入的研究，其具體分子機(jī)制有待闡明。
　　研究目的：
　　本課題以ADAR1為中心，試圖闡明ADAR1缺失對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的影響及其機(jī)制。我們推測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ADAR1對(duì)于維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)是不可或缺的。
　　1.在體外利用siRNA干擾內(nèi)皮細(xì)胞ADAR1表達(dá)，檢測(cè)與分析內(nèi)皮細(xì)胞小管形成、細(xì)胞滲透性以及內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)功能蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，探索ADAR1對(duì)內(nèi)

4、皮細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制。
　　2.觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性ADAR1基因敲除小鼠表型，檢測(cè)條件性敲除小鼠血管滲透性和血管新生功能，初步探討ADAR1對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響，以了解ADAR1對(duì)于血管穩(wěn)態(tài)維持的重要作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　研究方法：
　　利用ADAR1 flox/flox小鼠和VE-Cadherin-Cre小鼠雜交培育生成ADAR1flox/flox, Cre/+小鼠，即內(nèi)皮細(xì)胞特異性ADAR1基因敲除小鼠;

5、 ADAR1 flox/flox, Cre/-小鼠作為野生型對(duì)照小鼠。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)利用ADAR1siRNA干擾人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)作為ADAR1基因沉默細(xì)胞模型。應(yīng)用H&E染色、免疫組織化學(xué)法、免疫熒光法和透射電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞特異性ADAR1基因敲除小鼠病理學(xué)改變;應(yīng)用伊文氏蘭(Evans blue，EB)滲透性方法評(píng)估細(xì)胞和小鼠血管ADAR1缺失后

6、滲透性變化;應(yīng)用下肢缺血模型和主動(dòng)脈環(huán)血管生成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞特異性ADAR1基因敲除小鼠血管新生功能;應(yīng)用Western Blot法和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ADAR1缺失后內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.通過(guò)ADAR1 siRNA基因沉默HUVECs ADAR1表達(dá)觀察其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。結(jié)果表明與對(duì)照siRNA相比，ADAR1siRNA顯著抑制HUVECs增殖、小管形成功能，同時(shí)顯著增加細(xì)胞

7、滲透性。
　　2.通過(guò)免疫印跡法和免疫熒光法檢測(cè)了ADAR1siRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明Caveolin-1在ADAR1 siRNA干預(yù)后表達(dá)顯著低于對(duì)照siRNA組，而VEGF、Sprouty2、p-eNOS和MMP-9在兩組間均無(wú)顯著差異。此外，ADAR1 siRNA顯著抑制Caveolin家族另一亞型Caveolin-2和Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表達(dá)。
　　3.用胞膜

8、通透的Caveolin-1類(lèi)似物-Cavtratin預(yù)處理HUVECs顯著緩解ADAR1siRNA對(duì)HUVECs小管形成和細(xì)胞滲透性的損傷作用，并上調(diào)Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表達(dá)。
　　4.利用Flox/Cre系統(tǒng)成功培育出內(nèi)皮細(xì)胞特異性ADAR1基因敲除小鼠。觀察該小鼠表型發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異性ADAR1敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠出生后4周內(nèi)死亡75％。病理學(xué)檢查各臟器發(fā)現(xiàn)，ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠肺臟組織肺泡上皮增

9、生，部分肺泡腔內(nèi)出血，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)增厚。而與野生型小鼠相比，頸動(dòng)脈、主動(dòng)脈、心臟、肝臟和腎臟均無(wú)明顯改變。
　　5.透射電鏡觀察肺臟內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ADAR1內(nèi)皮特異性敲除小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間間隙增寬。Evans Blue血管滲透性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮特異性敲除ADAR1增加小鼠肺臟血管滲透性。通過(guò)免疫印跡法和免疫熒光法檢測(cè)肺臟發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠肺臟Caveolin-1/VE-cadherin表達(dá)較野生型小鼠顯著下降。
　　

10、6.通過(guò)主動(dòng)脈環(huán)血管形成實(shí)驗(yàn)和下肢缺血模型檢測(cè)小鼠血管新生功能。結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞缺失ADAR1顯著抑制小鼠胸主動(dòng)脈血管形成;與野生型小鼠相比，內(nèi)皮特異性ADAR1敲除小鼠下肢缺血后血流恢復(fù)顯著抑制，并且模型組下肢肌肉缺血后血管新生明顯受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1.ADAR1 siRNA可抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管形成和增加細(xì)胞滲透性。
　　2.ADAR1 siRNA損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能與抑制Caveolin-1/VE-cadher

11、in表達(dá)有關(guān);Cavtratin可逆轉(zhuǎn)ADAR1 siRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。
　　3.ADAR1內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除小鼠因肺損傷而導(dǎo)致小鼠出生后部分死亡。
　　4.ADAR1內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除可增加小鼠血管滲透性，抑制下肢缺血后血流恢復(fù)和主動(dòng)脈環(huán)血管形成功能。
　　5.ADAR1內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除可抑制肺臟血管Caveolin-1/VE-cadherin的表達(dá)。
　　我們?cè)谶@項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)ADAR1敲除增加血管