1、現(xiàn)代新藥研發(fā)中,大量候選藥物由于其低水溶性、低生物利用度或毒性較大等問題而難以走向臨床應用。另一方面,目前臨床治療使用的大量小分子藥物,由于疏水性導致的溶解度問題和較低的口服生物利用度也大大限制了其更有效而廣泛的臨床應用。新型藥物遞送系統(tǒng)為解決此類提供了有效手段,其中納米釋藥系統(tǒng)因其微小的粒徑和特殊結構而具備一系列獨特優(yōu)勢,是目前先進藥物遞送系統(tǒng)研究的前沿和熱點。廣泛的研究表明,納米釋藥系統(tǒng)可以顯著增加難溶性藥物的溶解度,同時大大提高許

2、多藥物的口服生物利用度。此外,通過被動及主動靶向方式,納米遞送系統(tǒng)可顯著提高藥物療效,降低藥物毒副作用和不良反應。聚合物自組裝體是納米遞送系統(tǒng)中最為廣泛研究的微粒系統(tǒng)之一,該類納米微粒系統(tǒng)被廣泛用于包括小分子藥物、多肽、蛋白和核酸等在內的各種藥物的遞送研究中。聚合物自組裝體一般是指親水或兩親性聚合物通過非共價鍵作用(包括疏水、靜電、氫鍵等)介導的自組裝形成的聚合物微粒系統(tǒng)。疏水性藥物一般通過疏水作用物理包裹于聚合物納米組裝體的疏水微區(qū)中

3、。然而,單一的疏水作用往往導致最終納米組裝體中藥物負載量很低,而提高投藥量又會導致藥物形成結晶。盡管可以通過提高劑量的方式達到治療目的,但這同時大大增加了聚合物載體材料的用量,使得一方面治療成本增加,另一方面過多聚合物材料的使用會直接導致毒副作用。此外,制備聚合物自組裝體使用的共聚物,其化學結構往往較為復雜,合成過程繁瑣,不宜進行準確的結構表征,且大規(guī)模合成批次重復性差,因此也是限制聚合物自組裝體納米釋藥系統(tǒng)臨床應用的關鍵因素之一。

4、r>　　綜上所述,構建安全有效的、藥物負載性能好、制備簡便、且易于規(guī)?；苽涞木酆衔镒越M裝體具有十分重要的意義。本課題創(chuàng)新性地提出通過聚合物和藥物間的多重非共價鍵作用構建聚合物納米組裝體的設想。為了驗證該假設,本研究首先選擇商品化的聚乙烯亞胺(PEI)均聚物為模型載體材料,選用非甾體類抗炎藥吲哚美辛(IND)為模型藥物,開展了多重非共價鍵作用構建聚合物自組裝體納米釋藥系統(tǒng)的研究。由于PEI同時含有伯胺、仲胺和叔胺基團,IND含有羧基和疏

5、水單元,PEI與IND之間同時存在靜電、氫鍵及疏水相互作用。在深入研究PEI與IND之間不同作用方式,并詳細表征所得納米組裝體理化特性的基礎上,選擇結構不同的模型藥物分子證明了該策略的普適性。通過口服給藥開展了大鼠體內藥動學研究,并通過急性和慢性炎癥模型進行了體內藥效學評價工作。為探究基于PEI/藥物組裝體作為口服釋藥系統(tǒng)的潛在應用,對分子量為800和25000的PEI進行了口服急性毒性評價。在此基礎上,為了進一步提高載體材料PEI的生

6、物相容性,在本課題的第二部分研究中,我們設計、合成了β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)。β-環(huán)糊精的引入一方面可起到降低載體材料毒性作用的目的;另一方面,也賦予了材料與藥物之間額外的非共價鍵作用,即環(huán)糊精空腔與疏水基團之間的主-客體相互作用,更有利于納米粒自組裝體的形成。為了實現(xiàn)口服后病灶部位的靶向,在成功構建PEI/IND聚合物納米組裝體的基礎上,我們采用酵母細胞壁作為微囊包被PEI/IND納米微粒。通過酵母細胞壁中β-1,3葡

7、聚糖與巨噬細胞表面β-葡聚糖受體之間的識別作用來靶向巨噬細胞,進而實現(xiàn)巨噬細胞介導的炎癥部位靶向。同樣,對于酵母細胞壁包裹PEI/IND納米組裝體系統(tǒng),我們開展了體內藥動學和藥效學研究。
　　方法：
　　1.含羧基小分子藥物的PEI或PEI-CD納米組裝體微粒的制備
　　通過透析法來制備PEI和不同小分子羧基藥物的納米組裝體,具體方法如下:首先將一定比例的藥物和PEI溶于一定體積的親水性有機溶劑中,得到的溶液于室溫下透

8、析去除有機溶劑記得制備得到納米組裝體水溶液?；赑EI-CD的納米組裝體采用改良的透析法來制備,制備時,將溶于水溶性有機溶劑中的藥物溶液在超聲作用下加入一定濃度的PEI-CD水溶液中,得到的混合體系在水溶液中透析即可得到載藥組裝體溶液。其中涉及的含羧基的小分子藥物包括吲哚美辛、布洛芬、萘普生、二氟尼柳和氟比洛芬等。
　　2.酵母細胞壁包裹納米組裝體系統(tǒng)的制備
　　首先通過酸堿處理出去酵母內容物得到酵母細胞壁(YS)。包裹PE

9、I/IND納米組裝體時,稱取一定量的酵母細胞,加入PEI水溶液超聲搖勻后,于37℃孵育使YS完全溶脹,再加入含有IND的DMSO溶液,搖勻后孵育一定時間,離心洗滌除去DMSO和未包裹PEI/IND,凍干即可得到酵母細胞載藥微囊(DL-YS)。
　　3.釋藥系統(tǒng)的理化性能表征
　　其中載藥量與包封率采用紫外法(UV)測定。通過掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)來觀察組裝體形貌。動態(tài)光散射

10、法(DLS)測定載藥組裝體微粒形態(tài)、大小及分布;表面電位儀測定表面電位。
　　4.載藥組裝體中藥物存在形式的表征
　　通過差示掃描量熱儀(DSC)和X-射線衍射儀(XRD)以及激光共聚焦顯微鏡(CLSM)表征載藥組裝體中藥物的存在形式和分布行為。
　　5.藥物-聚合物間多重相互作用的表征
　　聚合物的結構通過核磁共振光譜(1HNMR)來確定。藥物、聚合物、藥物聚合物物理混合物及載藥組裝體分別進行紅外光譜(FT-I

11、R)和核磁共振光譜(NMR)測定,以分析其多重相互作用力的存在。
　　6.β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)的合成
　　通過對甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精與聚乙烯亞胺之間的親核取代反應制備β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)。
　　7.體外釋放及模擬胃腸道研究
　　對含有IND的納米組裝體進行了體內釋放動力學研究,具體方法如下。取含有一定量藥物的載藥組裝體水溶液進行體外釋放實驗,同時選擇原料藥、片劑為對照

12、樣品。分別在pH7.4的PBS緩沖液和模擬胃腸道環(huán)境的不同釋放液中進行釋放實驗。藥物釋放量通過UV法測定,計算累計釋放百分率,并繪制藥物累積釋放曲線。
　　8.大鼠體內藥代動力學研究
　　SD大鼠口服灌胃給藥后,預定時間點采集血樣,離心后取一定量血漿,通過乙腈沉淀蛋白,內標法測定IND濃度,繪制藥時曲線,DAS軟件計算主要藥動學參數。
　　9.載藥組裝體在腸道內保留時間及其對胃腸道刺激研究
　　使用熒光標記聚合物

13、制備IND載藥組裝體,SD大鼠灌胃給藥后,預定時間點將其處死立即取胃腸道組織,進行病理切片。HE染色后顯微鏡下觀察胃腸道刺激情況,熒光顯微鏡下觀察載藥組裝體在腸道內的滯留情況。
　　10.量子點/酵母細胞壁(QD-YS)的制備
　　通過表面帶有正電荷的量子點(QD)的自發(fā)沉積來制備載有量子點的酵母細胞微囊。即,取一定量酵母空微囊,加入一定體積量子點在37℃下孵育一段時間,通過離心洗滌除去未包裹量子點。
　　11.活體成

14、像觀察
　　使用裸鼠來建立關節(jié)炎模型,口服一定量QD-YS,24h后取主要臟器和右后爪進行活體成像觀察,并對各臟器和足趾部位熒光強度進行定量,以此研究酵母微囊系統(tǒng)的關節(jié)炎靶向作用。
　　12.藥效學評價方法
　　通過角叉菜膠誘導的急性足趾腫脹模型和弗氏佐劑誘導的慢性關節(jié)炎模型來評價本研究所構建的不同釋藥系統(tǒng)的療效,以預防和治療兩種方式給藥進行研究;實驗結束后取胃、腸道不同部位和腫脹足趾組織,進行病理切片,HE染色。

15、r>　　13.口服急性毒性評價
　　選擇昆明小鼠,通過灌胃給予不同劑量的PEI,對照組給予生理鹽水,連續(xù)觀察14天。觀察的指標包括一般指標(如動物外觀、行為、對刺激的反應、分泌物、排泄物等),動物死亡情況(死亡時間、瀕死前反應等),動物體重變化(每兩天稱重一次)等;記錄所有的死亡情況、出現(xiàn)的癥狀,以及癥狀起始的時間、嚴重程度、持續(xù)時間等。對所有動物進行大體解剖,觀察器官變化情況,對任何器官出現(xiàn)體積、顏色、質地的改變,均記錄并進行組

16、織病理學檢查。
　　結果：
　　1.通過簡便的透析法可以成功制備IND與PEI的納米組裝體,其形態(tài)為球形,粒徑大小在幾十納米至幾百納米之間,表面帶正電荷;其中藥物負載量高達80％。采用不同含羧基藥物進行的研究表明該自組裝方法具有普適性。
　　2.基于FT-IR和NMR的研究表明,PEI與羧基小分子藥物間存在多重非共價鍵相互作用,包括氫鍵、靜電作用和疏水作用;通過DSC和XRD測定和CLSM觀察表明,藥物與聚合物組裝體中

17、藥物以無定形態(tài)存在,藥物均勻分散于組裝體中。
　　3.體外藥物釋放研究表明,PEI/IND納米組裝體明顯加快藥物的溶出和釋放,且其釋放具有pH響應特性,在胃部幾乎不釋放,而主要在腸道釋放;體內藥動學實驗結果表明,通過制備成PEI/IND納米組裝體能夠有效提高藥物的口服生物利用度;基于急性足趾腫脹模型和慢性炎癥模型進行的體內藥效學研究表明,納米組裝體釋藥系統(tǒng)大大提高了藥物的治療效果,同時并不會導致明顯的毒副作用或不良反應。
　

18、　4.口服急性毒性評價表明,PEI口服半致死劑量在2.5g/kg以上;臟器指數計算、血常規(guī)與肝腎功測定表明,在2.5g/kg以下口服PEI不會產生明顯的毒副作用。
　　5.在PEI中引入β-環(huán)糊精后得到的PEI-CD,其與羧基藥物組裝形成納米微粒的性能不會改變,PEI-CD/羧基藥物組裝體同樣具有高藥物負載量,并能加快藥物溶出,提高藥物口服生物利用度和體內治療效果;急性毒性評價表明β-環(huán)糊精的引入能明顯降低PEI的口服毒性。

19、>　　6.通過靜電作用,酵母空微囊可以成功包裹PEI-IND納米組裝體,由此得到酵母載藥微囊,載藥量最高達到30%,而包封率可達70%;通過Zeta電位、TEM和CLSM觀察證明PEI/IND被成功包被于酵母細胞壁內。
　　7.大鼠灌胃給藥后進行的藥動學研究表明,載藥酵母微囊INDYS能大大提高藥物的口服生物利用度,且INDYS較IND/PEI略有提高;同樣,基于角叉菜膠誘導的急性炎癥模型及弗氏佐劑誘導的慢性關節(jié)炎模型研究亦表明I