1、目的:
　　探求TDP-43(TAR DNA-binding protein43)與β-淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(the intracellular domain of Amyloid Precursor Protein,AICD)之間的關(guān)系,從而揭示其在阿爾茨海默病病理機(jī)制中可能發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1.運(yùn)用免疫熒光染色方法在HEK293/COS7細(xì)胞系上檢測(cè)TDP-43與AICD在細(xì)胞水平的是否存在共定位。

2、2.在細(xì)胞系上轉(zhuǎn)染克隆質(zhì)粒TDP-43-V5、APP-FLAG,48h后收集細(xì)胞提取蛋白,用免疫共沉淀(co-immunoprecipitations)的方法檢測(cè)APP(β淀粉樣蛋白前體蛋白)與 TDP-43在蛋白水平是否結(jié)合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大腦組織上用免疫共沉淀方法證明內(nèi)源性的TDP-43與APP在正常小鼠腦組織中是否存在結(jié)合關(guān)系。進(jìn)一步在細(xì)胞系上轉(zhuǎn)染質(zhì)粒TDP-43-V5、AICD-FLAG,以明確TDP-43是

3、否與AICD存在結(jié)合關(guān)系。3.用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試方法檢測(cè)TDP-43對(duì)AICD是否存在轉(zhuǎn)錄作用,進(jìn)一步加入APPγ酶切位點(diǎn)的分泌酶抑制劑,觀察這種轉(zhuǎn)錄作用是否有變化。用Real-Time PCR的方法檢測(cè)這種轉(zhuǎn)錄作用對(duì)P53 mRNA水平的影響。4.在分別轉(zhuǎn)染了AICD,TDP-43, AICD+TDP-43的細(xì)胞系上計(jì)數(shù)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞,直接比較對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。使用TUNEL法再次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:

4、　　1.免疫熒光染色,觀察到在體外培養(yǎng)的HEK293/COS7細(xì)胞系上,TDP-43在細(xì)胞水平定位于胞核,AICD大部分位于胞核,且二者存在共定位關(guān)系。2.在細(xì)胞系上轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,進(jìn)一步證明了TDP-43與AICD在蛋白水平存在結(jié)合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大腦組織上檢測(cè)到內(nèi)源性的TDP-43與AICD存在結(jié)合。3. TDP-43對(duì)AICD有類(lèi)似于Fe65樣的轉(zhuǎn)錄激活作用,但是這種作用可以被加入的APPγ酶切位點(diǎn)的分泌酶抑制劑所阻

5、斷(***p<0.001;NS:無(wú)意義)。TDP-43有類(lèi)似與AICD的作用,增加P53 mRNA的表達(dá)水平,從而促進(jìn)TP53基因編碼的P53蛋白的轉(zhuǎn)錄作用,且TDP-43可以增強(qiáng)AICD該種轉(zhuǎn)錄激活作用(*:p<0.05;**:p<0.01;***p<0.001)。4. TDP-43在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面有與AICD類(lèi)似的作用,其增加Caspase-3陽(yáng)性或TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),促進(jìn)細(xì)胞凋亡;并且TDP-43可以增強(qiáng)AICD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的