1、研究背景和目的:
　　視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelial，RPE)細胞的變性、壞死和丟失可造成視網(wǎng)膜和脈絡膜的損害，導致視網(wǎng)膜變性類疾病的發(fā)生和視力下降。目前尚無有效治療RPE變性的方法。細胞移植是治療RPE細胞變性的具有前景的方法，但是如何獲得數(shù)量充足的、低免疫排斥和低成瘤風險的RPE細胞是目前細胞治療RPE變性的所面臨的主要問題。而在可用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的干細胞中，胚胎干細胞（embryoni

2、cstemcells，ESCs）因其全能分化特性（可分化為包括RPE在內(nèi)的體內(nèi)所有細胞類型）和無限增殖能力，被認為是可用于視網(wǎng)膜變性類疾病治療的重要種子細胞。然而，ESCs來源的治療細胞的免疫排斥和成瘤風險、以及不可控增殖、倫醫(yī)學等問題限制了ESCs的臨床轉(zhuǎn)化。和ESCs相比，目前已在臨床廣泛應用的自體成體干細胞可避免免疫排斥和成瘤風險，且自體取材可規(guī)避倫理障礙。在本課題中，我們重點研究是否能將成體干細胞中的間充質(zhì)干細胞(mesench

3、ymalstemcells，MSCs)誘導分化為RPE樣的細胞，并且具備天然RPE細胞的生理功能，并最終轉(zhuǎn)化成為治療視網(wǎng)膜變性類疾病的理想種子細胞。
　　方法:
　　1、hMSCs和豬RPE細胞的分離
　　(1)原代分離和純化獲得hMSCs和豬RPE細胞，觀察細胞形態(tài);
　　(2)hMSCs和豬RPE細胞標記檢測、hMSCs成骨誘導分化鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、成軟骨誘導分化甲苯胺藍染色和成脂肪誘導分化油紅-0染色鑒定h

4、MSCs;免疫熒光鑒定豬RPE細胞。
　　2、hMSCs和豬RPE的共培養(yǎng)及其向RPE細胞的分化
　　(1)Transwell共培養(yǎng)法誘導hMSCs向RPE細胞分化;條件培養(yǎng)基法誘導hMSCs向RPE細胞分化;
　　(2)hMSCs來源RPE細胞的鑒定
　　細胞形態(tài)學觀察、細胞內(nèi)色素含量的定量分析、透射電鏡檢測、Real-timePCR、免疫熒光染色檢測、吞噬實驗和細胞斷層掃描、WesternBlot、驗證MER

5、TK蛋白在誘導細胞特異性吞噬功能中的作用和誘導細胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌能力檢測。
　　3、hMSCs來源RPE細胞對急、慢性視網(wǎng)膜變性的修復作用
　　(1)碘酸鈉注射制備急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型及鑒定:HE染色和F-ERG檢測;
　　(2)急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型視網(wǎng)膜下腔移植分別于移植后4周、8周檢測以下指標:細胞形態(tài)學觀察、免疫熒光染色檢測hESCs來源的RPE細胞、吞噬實驗和細胞斷層掃描、移植后免疫熒光染色檢測、F-E

6、RG和WesternBlot。
　　(3)選取21天齡的RCS白化大鼠進行視網(wǎng)膜下腔移植，分別于移植后4周、8周檢測以下指標:外核層厚度的測量、移植后細胞的免疫熒光染色檢測、F-ERG和WesternBlot檢測細胞在體的吞噬能力。
　　結(jié)果:
　　1、hMSCs的鑒定
　　(1)hMSCs形態(tài)多為梭形成纖維細胞樣外觀，呈旋渦狀排列;豬RPE細胞外形呈多邊形，細胞內(nèi)充滿了棕黑色的色素顆粒;
　　(2)hMS

7、Cs的表面標志CD73、CD90、CD105表達強陽性，而CD14、CD45、CD34陰性;茜素紅染色后，細胞間出現(xiàn)致密的、圓形不透光團塊狀的紅色結(jié)節(jié);阿新藍染色可見細胞外基質(zhì)被染成藍色，成條索狀錯綜排列;油紅-0染色細胞中含有被染成紅色的脂肪顆粒;豬RPE細胞CRALBP、RPE65、ZO-1表達均為陽性。
　　2、hMSCs向RPE細胞的分化
　　(1)hMSCs共培養(yǎng)誘導后的RPE樣細胞可觀察到hMSCs中出現(xiàn)豐富的色

8、素顆粒，含量接近于成體豬的RPE細胞，而采用條件培養(yǎng)基誘導法獲得細胞色素含量較少;
　　(2)共培養(yǎng)hMSCs-RPE細胞的色素含量與RPE細胞相比無統(tǒng)計學差異，條件培養(yǎng)基誘導hMSCs-RPE細胞內(nèi)色素顆粒含量與共培養(yǎng)hMSCs-RPE細胞的色素含量相比具有統(tǒng)計學差異;
　　(3)透射電鏡觀察見hMSCs-RPE細胞內(nèi)可見成熟的色素顆粒，細胞頂端可見典型的微絨毛結(jié)構(gòu);
　　(4)hMSCs-RPE細胞表達RPE細胞特

9、異的基因MITF、OTX2、tyrosinase、RPE65、Bestrophine、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6和誘導前相比都顯著上調(diào)，且和原代分離的人RPE細胞的表達水平相類似;
　　(5)hMSCs-RPE細胞可表達RPE細胞特異的蛋白CRALBP、RPE65和ZO-1;
　　(6)FITC標記的POS和hMSCs-RPE細胞共孵育后，豬RPE細胞和誘導細胞內(nèi)均可觀察到綠色熒光，而未誘導的hMSCs內(nèi)

10、未見到綠色熒光;hMSCs-RPE細胞MERTK蛋白表達顯著上調(diào)，αvβ5Integrin的表達也有所上調(diào)，MERTK抗體封閉掉該受體的功能后，吞噬POS的能力顯著下降;
　　(7)hMSCs-RPE細胞BDNF和GDNF的分泌量上調(diào)明顯，但仍顯著低于豬RPE細胞。
　　3、hMSCs來源RPE細胞對急、慢性視網(wǎng)膜變性的修復作用
　　(1)碘酸鈉損傷模型的視網(wǎng)膜HE染色可見后極部RPE細胞幾乎完全損毀，部分RPE細胞死

11、亡后殘留的色素團塊殘留于Bruch's膜上，上方的感光細胞層呈波浪形;F-ERG顯示A波和B波的幅值較正常大鼠均顯著降低;
　　(2)碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，hMSC來源的RPE細胞可表達mitochondrial和CRALBP;
　　(3)碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周F-ERG結(jié)果顯示了hMSCs-RPE細胞移植后較偽手術(shù)組和移植未誘導分化的

12、hMSC組，A波和B波的波幅明顯升高，具有統(tǒng)計學意義;
　　(4)碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜總蛋白的WesternBlot結(jié)果顯示rhodopsin的表達量在移植hMSCs-RPE細胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組明顯升高，具有統(tǒng)計學意義。
　　(5)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周hMSCs-RPE細胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度明顯增厚，具有統(tǒng)計學意義;

13、　　(6)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，hMSC來源的RPE細胞可表達mitochondrial和CRALBP，但在8周時間點移植細胞存活較4周明顯減少;
　　(7)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周F-ERG結(jié)果顯示hMSCs-RPE細胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組，A波和B波的波幅明顯升高，，具有統(tǒng)計學意義;而在移植后8周，各組電生理均呈熄滅型，各組間幅值無統(tǒng)計學差異;

14、>　　(8)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周視網(wǎng)膜總蛋白的WesternBlot結(jié)果顯示，MERTK蛋白的表達在移植hMSC來源的RPE細胞組4周為陽性8周時呈陰性，偽手術(shù)4周、8周均為陰性;
　　(9)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，4周時RPE65陽性的移植細胞內(nèi)存在rhodopsin陽性的感光細胞外節(jié)，而8周時未見RPE65陽性的移植細胞內(nèi)存在rhodopsin陽性的

15、感光細胞外節(jié)。
　　結(jié)論:
　　1、成功分離獲得了hMSCs和豬RPE細胞，獲得細胞的細胞形態(tài)和細胞表面標志符合hMSCs和豬RPE細胞的特性;
　　2、通過Transwell構(gòu)建hMSCs和RPE細胞的體外非接觸共培養(yǎng)體系，誘導hMSCs向RPE細胞分化，誘導的RPE細胞的體外生物學特性和功能類似于原代分離的RPE細胞。
　　3、碘酸鈉尾靜脈注射制造的急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型，其視網(wǎng)膜組織和結(jié)構(gòu)改變符合急性視網(wǎng)膜