1、自上個(gè)世紀(jì)90年代初期發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)以來，目前被證實(shí)的內(nèi)源性大麻素有N-花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酰甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)，它們通過作用于大麻素受體CB1和CB2發(fā)揮生物活性。大量研究表明，內(nèi)源性大麻素具有神經(jīng)保護(hù)活性，因此內(nèi)源性大麻素作用的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)被認(rèn)為是新型神經(jīng)保護(hù)藥物的靶點(diǎn)。近年來，內(nèi)源性大麻素的失活系統(tǒng)逐漸成為上述研究的新熱點(diǎn)。
　

2、　在前期工作中，我們合成了一系列結(jié)構(gòu)與AEA相似的脂氨基酸類化合物，研究中我們通過大鼠離體腦片的缺氧缺糖損傷和原代皮層神經(jīng)元的損傷實(shí)驗(yàn)篩選出了具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用的N-硬脂酰酪氨酸(N-stearoyltyrosine，NsTyr)。本研究以NsTyr為研究對(duì)象，采用SD大鼠原代神經(jīng)元Aβ?lián)p傷模型和OGD損傷模型探討其神經(jīng)保護(hù)活性以及其通過內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制。
　　第一章 N-硬脂酰酪氨酸對(duì)抗Aβ?lián)p傷和OG

3、D損傷的神經(jīng)保護(hù)作用
　　β淀粉樣蛋白(Aβ)被認(rèn)為是阿爾茨海默癥的主要致病原因，缺血再灌注是腦卒中損傷及其炎癥反應(yīng)和氧化損傷的主要原因。由于缺乏有效的防治方法和手段，使得阿爾茨海默癥和腦卒中影響著人們的生活質(zhì)量，并造成了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　本研究采用了SD大鼠皮層神經(jīng)元建立Aβ?lián)p傷模型和OGD損傷模型，評(píng)價(jià)了NsTyr的抗Aβ毒性和抗OGD損傷神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用。我們采用10μg/mL Aβ(1-40)片段建立Aβ?lián)p傷模

4、型;采用缺氧缺糖1h恢復(fù)培養(yǎng)24 h的處理流程建立OGD損傷模型。通過MTT檢測(cè)和LDH檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)1-20μmol/L NsTyr對(duì)Aβ?lián)p傷和OGD損傷的原代皮層神經(jīng)元具有保護(hù)作用，10μmol/L NsTyr對(duì)Aβ?lián)p傷和OGD損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用最強(qiáng);結(jié)果還驗(yàn)證了AEA直接給藥的局限性。Western Blot檢測(cè)表明NsTyr可以上調(diào)神經(jīng)元中大麻素受體CB1的表達(dá)，進(jìn)一步提示了NsTyr的神經(jīng)保護(hù)作用與內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)

5、有關(guān)。
　　第二章 N-硬臘酰酪氨酸通過抗凋亡途徑對(duì)抗Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護(hù)作用
　　內(nèi)源性大麻素的神經(jīng)保護(hù)作用及其本身作為神經(jīng)保護(hù)藥物局限性的報(bào)道促使人們把研究重點(diǎn)放在尋找內(nèi)源性大麻素介導(dǎo)的高效低毒神經(jīng)保護(hù)劑上。
　　本文研究通過Hoechst33342染色和TUNEL熒光染色發(fā)現(xiàn)Aβ和OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷是通過凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的，而NsTyr確能有效抑制這兩種損傷模型的神經(jīng)元凋亡。在損傷后和NsTyr處理后，

6、采用Western Blot檢測(cè)促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果表明NsTyr可以下調(diào)損傷引起的Bax表達(dá)升高，并可上調(diào)損傷引起的Bcl-2表達(dá)降低。同樣觀察到NsTyr可以通過上調(diào)ERK的磷酸化達(dá)到抑制損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。這些結(jié)果表明NsTyr通過抗凋亡途徑發(fā)揮對(duì)抗Aβ?lián)p傷和抗OGD損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。通過MTT檢測(cè)、LDH檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CB1阻斷劑AM251能逆轉(zhuǎn)NsTyr對(duì)Aβ?lián)p傷

7、和OGD損傷的保護(hù)作用，這進(jìn)一步提示了NsTyr是通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。
　　我們前期研究中得到NsTyr與CB1沒有親和力的結(jié)果，提示NsTyr不是通過與CB1結(jié)合激動(dòng)大麻素信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的，本章證明NsTyr是通過抗凋亡途徑實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用的，這些結(jié)果凸顯了揭示NsTyr通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮抗凋亡的作用機(jī)制的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　第三章 N-硬脂酰酪氨酸通過介導(dǎo)內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)對(duì)抗Aβ

8、損傷和OGD損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用
　　脂氨基酸能抑制AEA水解酶FAAH活性的報(bào)道，促使我們研究NsTyr對(duì)FAAH的抑制作用。
　　為了明確NsTyr對(duì)FAAH的直接抑制作用，我們通過熒光底物檢測(cè)，證明NsTyr是通過抑制FAAH的活性(IC50=16.54 nmol/L)，發(fā)揮其對(duì)Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NsTyr可以下調(diào)Aβ?lián)p傷和OGD損傷導(dǎo)致的FAAH表達(dá)的升高，提示

9、NsTyr具有蛋白水平對(duì)FAAH表達(dá)的抑制作用;而對(duì)FAAH mRNA的檢測(cè)表明，NsTyr也具有mRNA水平對(duì)FAAH表達(dá)的抑制作用。這些結(jié)果表明，NsTyr通過多種途徑抑制FAAH的活性，實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。為了進(jìn)一步明確NsTyr對(duì)FAAH的抑制作用，我們應(yīng)用了非選擇性FAAH抑制劑LY2183240和選擇性FAAH抑制劑URB597，對(duì)比評(píng)價(jià)分別應(yīng)用抑制劑及NsTyr對(duì)Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護(hù)作用和對(duì)AEA失活途徑的抑制作

10、用。檢測(cè)細(xì)胞存活率、凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)、檢測(cè)Bcl-2、Bax及pERK蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，與URB597不同，NsTyr和LY2183240都在抑制FAAH活性的同時(shí)，阻斷AMT的功能。由于LY2183240是AMT阻斷劑，我們進(jìn)一步考察了NsTyr對(duì)AMT的直接作用。應(yīng)用3H放射性同位素檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NsTyr也能通過阻斷AEA膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能(IC50=11.74 nmol/L)發(fā)揮其對(duì)Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

11、明NsTyr可以下調(diào)由Aβ?lián)p傷和OGD損傷導(dǎo)致的AMT上游分子iNOS表達(dá)的升高和NO總量的增加。對(duì)iNOS的mRNA的檢測(cè)也進(jìn)一步確認(rèn)了這一結(jié)論。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了NsTyr既是FAAH抑制劑也是AEA轉(zhuǎn)運(yùn)體AMT的阻斷劑。
　　本研究首次明確了NsTyr抑制內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)抗Aβ?lián)p傷和OGD損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。這一結(jié)果進(jìn)一步豐富了NsTyr的神經(jīng)保護(hù)作用的理論依據(jù)，也為了NsTyr作為內(nèi)源性大麻素失活系統(tǒng)抑制劑的先