1、核糖核酸酶A超家族是一類可以水解RNA的核酸內切酶，其同源基因通常在染色質上成簇排列。核糖核酸酶-4（Ribonuclease-4，RNase-4）和血管生成素（Angiogenin，ANG）作為超家族的第四和第五個成員，它們的基因共享相同的啟動子區(qū)域以及部分5'-非翻譯區(qū)（5'-Untranslate Region，5'-UTR），之后緊隨兩個獨立的分別編碼ANG和RNase-4蛋白的外顯子。這種基因排列方式在核糖核酸酶A超家族中是唯

2、一的，并且在整個基因組中也是非常罕見的。目前，對于這種特殊排列結構基因的轉錄調控仍知之甚少。因此，我們利用生物信息學手段分析了人類ANG和RNase-4基因座位上可能的調控元件，希望從其調控元件著手闡明這種特殊基因結構的調控模式。根據(jù)基因表達加帽分析（Cap-Analysis of GeneExpression，CAGE）數(shù)據(jù)庫繪制了ANG和RNase-4基因轉錄起始位點，確定了基因啟動子的位置。進一步，通過體內的雙熒光素酶報告基因分析

3、，我們發(fā)現(xiàn)ANG和RNase-4基因的啟動子區(qū)域存在著兩個活性位點，即遠端啟動子活性位點(P1)和近端啟動子活性位點(P2)，并且被兩個tRNA順式作用元件(T1和T2)隔開。其中，遠端啟動子活性位點P1的啟動子活性被緊隨其后的tRNA順式作用元件T1所抑制，而位于近端啟動子活性位點P2前端的tRNA順式作用元件T1和T2可以顯著增強P2的啟動子活性。tRNA順式作用元件也可以位置依賴性的方式影響猿猴病毒40(SV40)啟動子的轉錄活性

4、。除此之外，實驗發(fā)現(xiàn)轉錄因子CTCF(CCCTC-binding factor, CTCF)結合于ANG蛋白編碼外顯子兩側的內含子中，從而促使基因內染色質環(huán)狀結構的形成，并將ANG蛋白編碼外顯子包裹于此結構中，最終促進ANG和RNase-4基因的表達水平。我們的研究結果為揭示人類ANG和RNase-4基因的轉錄調控機制奠定了基礎。
　　人類核糖核酸酶A超家族共有13個成員，每一個成員都具有其各自特有的生物學功能，例如宿主防御、血管

5、新生、促進\抑制腫瘤生長和激活免疫系統(tǒng)等。ANG是第一個基于其促血管新生功能從腫瘤細胞培養(yǎng)液中分離純化的核糖核酸酶，經過近30年的研究，對其在生理和病理條件下的作用機制已經有一定了解。已有實驗證明ANG可以與rRNA基因的ABE(Angiogenin Binding Element，ABE)序列結合并促進rRNA的轉錄，但是其具體的分子機制仍不明確。我們通過體內染色質免疫共沉淀技術在細胞內驗證了ANG除了可以與rRNA基因的ABE位點結

6、合外，還可以結合于rRNA基因啟動子的UCE（Upstream ControlElement，UCE）位點，通過調控rRNA基因啟動子區(qū)域的組蛋白修飾（包括組蛋白H4的乙?；⒔M蛋白H3的第四位上賴氨酸的二甲基化以及第九位上賴氨酸的二甲基化修飾）以及DNA甲基化等表觀遺傳學修飾，促進RNA聚合酶Ⅰ轉錄前起始復合物(Pre-initiation Complex，PIC)的組裝，最終增強rRNA基因的轉錄。除與rDNA區(qū)域結合外，一般認為A

7、NG也可以作為轉錄因子促進細胞內其它基因的表達，但ANG是否可以結合在這些基因的啟動子區(qū)域？本論文通過體內染色質免疫共沉淀與啟動子基因芯片篩選相結合的技術，繪制了ANG基因組結合位點圖譜，并且驗證了幾個直接受ANG調控的基因。
　　RNase-4和ANG是同時被發(fā)現(xiàn)的，但是目前RNase-4的生物學功能仍是一個謎。我們利用生物信息學手段分析發(fā)現(xiàn)RNase-4與ANG具有非常一致的基因表達譜，并且在腫瘤組織中高表達。同時，我們課題組

8、的前期工作也證明了RNase-4具有促血管新生、誘導神經發(fā)育以及在應激條件下保護神經元的功能。在此基礎上，本論文探討了RNase-4在腫瘤的生成與發(fā)展過程中的作用，結果顯示RNase-4在腫瘤組織中高表達，并且具有促腫瘤血管新生和促進腫瘤生長的雙重功能。因此，RNase-4是一種嶄新的促腫瘤生長因子，可能成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點。
　　綜上所述，本博士論文研究發(fā)現(xiàn):1.人類ANG和RNase-4基因表達受tRNA順式作用元件和