1、目的：構(gòu)建HIF-1α(缺氧誘導(dǎo)因子1α)的RNAi系統(tǒng)表達(dá)載體并研究其在前列腺癌細(xì)胞PC-3中的作用。
　　 方法：根據(jù)GenBank中HIF-1α序列信息，化學(xué)合成靶向HIF-1α基因的寡核苷酸鏈，退火、克隆到經(jīng)雙酶切的pSUPER.retro.puro載體上，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測(cè)序分析；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，檢測(cè)前列腺癌PC-3細(xì)胞內(nèi)

2、HIF-1α mRNA及其蛋白的表達(dá)情況；利用其puro抗藥性對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，觀察克隆生成情況；將單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)2周后收集細(xì)胞株，檢測(cè)pSUPER-siHIF-1α/PC-3細(xì)胞株中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切電泳及序列分析證實(shí)，目的片段成功插入到設(shè)計(jì)位點(diǎn)，并且序列完全一致，表明HIF-1α的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒與GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞36h后轉(zhuǎn)染效率為(87.15

3、±2.36)％；該質(zhì)粒可顯著降低前列腺癌PC-3細(xì)胞HIF-1α mRNA及其蛋白的表達(dá)，抑制效率分別為75.2％、72.8％(P＜0.05)加藥篩選2周可觀察到單克隆生成；pSUPER-siHIF-1α/PC-3細(xì)胞株中HIF-1α蛋白表達(dá)亦顯著降低，抑制效率為83.
　　 結(jié)論：利用RNAi技術(shù)可成功構(gòu)建抑制前列腺癌HIF-1α表達(dá)的siRNA重組表達(dá)載體，為研究HIF-1α在前列腺癌發(fā)病機(jī)理及增殖、轉(zhuǎn)移中的功能奠定了基礎(chǔ)，