1、目的：
　　 急性肝壞死(acute liver failure,ALF)時繼發(fā)的感染主要由腸道細菌易位所致,而腸道免疫屏障遭到破壞是發(fā)生腸道細菌易位的重要因為。分泌成分(secretorycomponent,SC)是多聚免疫球蛋白受體(polymeric Ig receptor,pIgR)的胞外段部分,主要負責pIgA的轉(zhuǎn)運和SIgA的形成,在維護腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),ALF時腸道pIgR/SC表達減少,

2、從而可導致SIgA分泌合成的減少,使其不能正常地在粘膜表面形成完整的SIgA屏障層,而導致腸源性感染的發(fā)生。甘草酸苷(glycyrrhizin),是甘草類制劑的典型代表藥物,具有抗炎、抗氧化、抗過敏及類固醇激素樣作用,被廣泛用于治療肝病及皮膚病等領域,是否glycyrrhizin能影響肝壞死時腸SC的表達尚未見報道。本研究通過肝壞死模型觀察glycyrrhizin預先保護組小鼠腸道SC表達變化探索glycyrrhizin在預防急性肝壞死

3、小鼠腸道SC表達減少中的作用,通過觀察人結腸上皮細胞系Caco-2在glycyrrhizin或在聯(lián)合糖皮質(zhì)激素受體抑制劑(RU486)的作用下,細胞內(nèi)SC蛋白和SC mRNA的表達情況以及glycyrrhizin對SC啟動子活性,SC啟動子結合轉(zhuǎn)錄因子-上游刺激因子(USF)的影響,探討glycyrrhizin影響SC表達的作用機制,為研究預防及治療肝壞死時腸粘膜免疫功能失調(diào)提供新的途徑和理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　

4、 一、材料
　　 1、動物:雄性Balb/c小鼠,6～8周,體重18～25克。
　　 2、細胞:Caco-2細胞。
　　 3、試劑:GAlN；LPS(Ecoli O127:B8)；Glycyrrhizin；山羊抗小鼠pIgR/SC抗體；小鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體；辣根過氧化物酶標記兔抗山羊二抗；辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠二抗；兔抗山羊SP試劑盒；BCA蛋白濃度測定液；SYBRRPrimeScriptTM

5、 RT-PCR Kit試劑盒；DEX；山羊抗人pIgR/SC抗體；兔抗人β-actin多克隆抗體；兔抗人USF1多克隆抗體；兔抗人USF2多克隆抗體；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗；辣根過氧化物酶標記兔抗山羊二抗；FITC標記兔抗山羊二抗；胎牛血清；DMSO；RU486。
　　 二、方法
　　 1、動物分組:實驗動物為雄性Balb/c小鼠,隨機分為5組。1組:生理鹽水(NS)對照組60只；2組:脂多糖(LPS)對照組60

6、只:3組:D氨基半乳糖(GalN)對照組60只；4組:急性肝壞死(ALF)模型組60只；5組:Glycyrrhizin預保護組(LPS/GalN/glycyrrhizin)60只。
　　 2、細胞培養(yǎng)及分組:參照Liu等的方法進行細胞培養(yǎng)。①觀察濃度影響:取6組非同代生長達融合的細胞,分別添加0μg/mL,4μg/mL,20μg/mL,100μg/mL,500μg/mL,1000μg/mL glycyrrhizin培養(yǎng)24h,提

7、取總蛋白和總RNA-130℃保存；②觀察時間影響:取5組非同代生長達融合的細胞,以100μg/mL glycyrrhizin分別處理0h、4h、8h、16h、24h,收集Caco-2細胞爬片甲醛固定及提取總蛋白和總RNA-130℃保存；③取6組非同代生長達融合的細胞,添加RU486(50nM)聯(lián)合20μg/mL glycyrrhizin或100nM DEX共培養(yǎng)24h,收集Caco-2細胞提取總蛋白和總RNA-130℃保存。
　　

8、 3、應用HE染色觀察肝臟病理改變和電鏡觀察腸組織病理變化。
　　 4、應用免疫組化染色、western blot和real-time PCR方法觀察glycyrrhizin對急性肝壞死小鼠腸道SC表達下降的影響。
　　 5、應用免疫熒光染色、western blot和real-time PCR方法檢測glycyrrhizin對Caco-2細胞SC蛋白及mRNA表達的影響。
　　 6、應用western blo

9、t和real-time PCR方法研究糖皮質(zhì)激素受體抑制劑(RU486)對glycyrrhizin上調(diào)腸上皮細胞SC表達的影響。
　　 7、將重組質(zhì)粒PGL2-SC promoter轉(zhuǎn)染Caco-2細胞,通過檢測螢火蟲熒光素酶報告基因的表達活性,說明glycyrrhizin對SC基因啟動子活性的影響。
　　 8、應用western blot和real-time PCR方法研究上游刺激因子(USF)及其mRNA表達,說明g

10、lycyrrhizin是否通過影響USF表達影響SC基因啟動子活性。
　　 結論：
　　 1.Glycyrrhizin可以有效預防肝壞死小鼠腸上皮細胞損傷；
　　 2.Glycyrrhizin可有效預防肝壞死小鼠腸SC蛋白表達減少,改善肝壞死小鼠腸粘膜免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào),從而保護腸粘膜上皮細胞損傷；
　　 3.Glycyrrhizin誘導了肝壞死小鼠腸SC基因表達,使SC蛋白合成增加；
　　 4.Gly

11、cyrrhizin使得Caco-2細胞pIgR/SC陽性細胞比例及pIgR/SC熒光強度增加；
　　 5.Glycyrrhizin劑量依賴性及時間依賴性上調(diào)Caco-2細胞SC蛋白表達；
　　 6.Glycyrrhizin通過誘導Caco-2細胞SC mRNA水平,增加SC蛋白表達；
　　 7.Glycyrrhizin上調(diào)腸上皮細胞SC表達并非通過糖皮質(zhì)激素受體；
　　 8.Glycyrrhizin可通過