1、雌激素對心肌缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用的研究雖然有許多報道,但是,有關(guān)研究雌激素對心肌保護(hù)的機(jī)制的報道較少。因此,有必要進(jìn)行深入的研究。17β雌二醇(17beta-estradiol,E2)除具有促進(jìn)生殖系統(tǒng)發(fā)育和維持生殖功能外,對心血管等器官還有保護(hù)作用。主要有抗炎作用、抗氧化作用、抗凋亡作用等。心肌細(xì)胞具有雌激素受體(estrogen receptor,ER),細(xì)胞活動受到17β-雌二醇調(diào)控。本研究建立培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧

2、(H/R)損傷模型,研究雌激素對心肌細(xì)胞的抗炎和抗氧化作用的機(jī)制。本研究分為三章。
　　 第一章17β-雌二醇對心肌缺氧/復(fù)氧保護(hù)作用的研究
　　 建立缺氧/復(fù)氧損傷模型,模擬心肌缺血再灌注損傷。實施外源性一定劑量的(E25μ M)孵育,通過α-Actin免疫組化染色進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定、通過倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、同時檢測上清液中CK、LDH、MDA含量,通過激光共聚焦顯微鏡檢測鈣瞬變和鈣濃度,采用MTT和流式細(xì)胞儀An

3、nexinⅤ和PI雙染實驗檢測細(xì)胞凋亡率和存活率。結(jié)果表明:培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷可導(dǎo)致細(xì)胞收縮、折光率下降、細(xì)胞突起減少；培養(yǎng)上清液中LDH、CK和MDA含量與對照組比較分別升高5.1倍、10.2倍和8.2倍；自發(fā)性鈣瞬變的幅值和時程均有增加,鈣超載明顯；中晚期凋亡細(xì)胞比對照組升高了10.83％,細(xì)胞存活率降低了40.9％。E2預(yù)處理可以減少心肌缺氧/復(fù)氧損傷,形態(tài)學(xué)損傷明顯減輕,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH、CK和MDA分別

4、比損傷組降低到2.7倍、2.7倍和2.4倍；鈣瞬變的幅值和時程與損傷組比較均有降低,與對照組無明顯差異；中晚期凋亡細(xì)胞比損傷組下降了9.32％；細(xì)胞存活率升高26.45％。E2具有明顯的保護(hù)細(xì)胞的作用。其作用主要是能保護(hù)心肌細(xì)胞形態(tài)和胞膜的完整性,減少心肌酶的滲漏,減少缺氧/復(fù)氧造成的鈣瞬變幅值和時程增加,抑制心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌細(xì)胞活性,提高心肌細(xì)胞的存活率。
　　 第二章17β-雌二醇對缺氧/復(fù)氧心肌NF-κ B及ICAM

5、-1和VCAM-1表達(dá)影響機(jī)制研究
　　 通過RT-PCR和ELISA觀察E2對ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響:通過流式細(xì)胞儀術(shù)和Western blot及激光共聚焦顯微鏡觀察E2對NF-κB核轉(zhuǎn)移和亞細(xì)胞定位的影響；通過RT-PCR和ELISA觀察E2對NF-κB抑制蛋白I-κB表達(dá)的影響。結(jié)果表明:E2對缺氧/復(fù)氧心肌ICAM-1和VCAM-1mRNA和蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用(P<0.05),阻止NF-κ B核轉(zhuǎn)移(

6、P<0.05)。通過PDTC干預(yù)實驗,分析了ICAM-1和VCAM-1mRNA水平和蛋白表達(dá)與NF-κB核轉(zhuǎn)移的相關(guān)性?？偨Y(jié)了E2對ICAM-1和VCAM-1mRNA水平和蛋白表達(dá)的抑制作用是通過阻止NF-κB核轉(zhuǎn)移實現(xiàn)的。E2對缺氧/復(fù)氧心肌NF-κB胞漿抑制蛋白I-κB mRNA水平和蛋白表達(dá)的影響不顯著。E2抑制ICAM-1和VCAM-1的表達(dá),減少心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧產(chǎn)生過度的炎性反應(yīng)。E2阻止NF-κB核轉(zhuǎn)移,減少NF-κB入核

7、量,抑制炎性因子的表達(dá),降低心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和炎性損傷。I-κB表達(dá)受NF-κB調(diào)控,再通過負(fù)反饋調(diào)節(jié),調(diào)控NF-κB入核量。E2對I-κB表達(dá)沒有影響。
　　 第三章17β-雌二醇對缺氧/復(fù)氧心肌Nrf2及GST和GCL表達(dá)影響機(jī)制研究
　　 通過RT-PCR和ELISA觀察E2對GST、GCL表達(dá)的影響；通過Western blot及激光共聚焦顯微鏡觀察E2對Nrf2核轉(zhuǎn)移和亞細(xì)胞定位的影響；通過RT

8、-PCR和ELISA觀察E2對Nrf2結(jié)合蛋白Keapl表達(dá)的影響。結(jié)果表明:E2對缺氧/復(fù)氧心肌GST和GCLmRNA和蛋白表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05),增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。E2的抗氧化作用與Nrf2/ARE抗氧化系統(tǒng)有密切關(guān)系。對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的入核過程有促進(jìn)作用(P<0.05)。使下游的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶表達(dá)上調(diào),增強(qiáng)抗氧化作用,保護(hù)細(xì)胞活性。E2對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的胞漿結(jié)合蛋白Keapl mRNA水平和蛋白表達(dá)