1、皰疹病毒宿主廣泛,引起人和許多動物多種多樣的感染。除急性感染外,還有潛伏感染和反復(fù)發(fā)作的傾向。皰疹病毒復(fù)制機理的研究對發(fā)展病毒與宿主細胞相互作用的理論、抗病毒藥物的開發(fā)以減輕皰疹病毒對人類健康的威脅、減少牛業(yè)的巨大經(jīng)濟損失有重要意義。皰疹病毒等大DNA病毒能編碼DNA聚合酶等DNA復(fù)制相關(guān)蛋白,且能在靜止細胞甚至終末分化的神經(jīng)細胞中復(fù)制,因此過去認為這些病毒的復(fù)制與細胞周期無關(guān),不需要細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的活性。1998

2、年發(fā)現(xiàn),藥理學劑量的CDK抑制劑(PCI)能抑制單純皰疹病毒(HSV)的復(fù)制。此后,CDK在病毒復(fù)制過程中的作用備受關(guān)注,而HSV成為研究病毒與宿主細胞相互作用的首選模型。 目前對于HSV等病毒復(fù)制所需CDK種類還不清楚。根據(jù)文獻資料分析和我們的前期實驗結(jié)果,我們的假設(shè)是:CDK2可能是HSV復(fù)制和重新激活的關(guān)鍵性啟動因素。本文以表達顯性負突變體CDK2(dn-CDK2)的HT29Tet-Ondn-CDK2細胞系、靶向Cycli

3、nA、CyclinE及CDK2的干擾RNA等多種措施抑制CDK2活性,研究CDK2在HSV復(fù)制中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSV在CDK2活性下降的HT29Tet-On dn-CDK2細胞中的增殖具有感染劑量依賴性；HSV感染宿主細胞6小時后CDK2活性被誘導(dǎo)；HSV增殖動力學分析表明在宿主細胞CDK2活性被誘導(dǎo)后,HSV即進入了快速增殖階段。這一發(fā)現(xiàn)首次直接證明了CDK2活性與HSV復(fù)制的關(guān)系。用微球菌核酸酶(MCN)消化進行的嘗試性實驗發(fā)現(xiàn)

4、:HSV感染CDK2下降細胞5小時后其基因組DNA仍以結(jié)構(gòu)緊密的染色體形式存在,HSV基因組的存在形式與宿主細胞CDK2活性有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為進一步研究CDK2調(diào)控HSV基因轉(zhuǎn)錄的機制提供了線索。 1.HSV在HT29Tet-On dn-CDK2細胞中的增殖特性HT29Tet-On dn-CDK2細胞整合了受Tet-On啟動子調(diào)控的dn-CDK2基因,在強力霉素(Dox)誘導(dǎo)下大量表達dn-CDK2蛋白而抑制細胞CDK2的活性。將

5、HT29Tet-On dn-CDK2細胞在有和無Dox條件下培養(yǎng)48小時,然后用不同劑量的HSV感染dn-CDK2誘導(dǎo)表達和未誘導(dǎo)表達的HT29Tet-On dn-CDK2細胞,24小時后收獲細胞,測定感染性HSV顆粒的生成量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高感染劑量的HSV(大于1PFU/Cell)在dn-CDK2誘導(dǎo)表達和未誘導(dǎo)表達的HT29Tet-Ondn-CDK2細胞中的生長無明顯差別,而低感染劑量(小于0.3PFU/Cell)的HSV感染dn-C

6、DK2誘導(dǎo)表達的HT29Tet-On dn-CDK2細胞24小時后感染性HSV顆粒的生成量較未誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細胞中要低10倍以上。說明HSV在dn-CDK2誘導(dǎo)表達的HT29Tet-On dn-CDK2細胞中的生長具有感染劑量依賴性。這一現(xiàn)象與ICP0功能缺陷型HSV在培養(yǎng)細胞中的行為相似。提示細胞CDK2或者其產(chǎn)物有可能是HSV ICP0蛋白功能的替代者。 2.HSV復(fù)制與CDK2活性的關(guān)系為進一步分析HS

7、V能在CDK2功能缺陷型宿主細胞HT29Tet-On dn-CDK2中增殖的原因,我們用HSV感染Dox充分誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細胞,每隔3小時收獲細胞,測定CDK2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSV感染6小時后,Dox誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細胞中CDK2活性開始升高,9小時達到最大,12小時活性下降。HSV的增殖動力學分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSV感染非誘導(dǎo)的HT29Tet-Ondn-CDK2細胞6小時時感染性H

8、SV顆粒的生成量最低,9小時后病毒產(chǎn)量上升。而感染dn-CDK2誘導(dǎo)表達的HT29Tet-On dn-CDK2細胞9小時時感染性HSV顆粒的生成量最低,12小時后病毒產(chǎn)量上升。較在未誘導(dǎo)的HT29Tet-On dn-CDK2細胞中的復(fù)制延遲3小時。這9小時恰好是CDK2活性被誘導(dǎo)所需要的時間,CDK2活性被誘導(dǎo)后HSV才進入了快速復(fù)制階段。這一發(fā)現(xiàn)提示HSV的復(fù)制與CDK2活性密切相關(guān)；HSV通過誘導(dǎo)宿主細胞CDK2活性而促進了其本身復(fù)

9、制的啟動。 3.靶向CDK2的siRNA對HSV的復(fù)制的抑制作用為進一步驗證CDK2在HSV復(fù)制中的作用,我們構(gòu)建了靶向CDK2、CyclinA、CyclinE的siRNA表達載體,共轉(zhuǎn)染Vero細胞,觀察重組病毒HSV-GFP在CDK2活性被抑制的轉(zhuǎn)染細胞中的基因表達情況。發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染CDK2 siRNA的細胞HSV-GFP基因表達正常,而轉(zhuǎn)染CDK2 siRNA抑制了CDK2的活性后,HSV的HSV-GFP基因表達也受到了抑制

10、。進一步證明了CDK2在HSV復(fù)制中的重要性。靶向CDK2、CyclinE和CyclinA的siRNA聯(lián)合作用對HSV復(fù)制的抑制程度最強。 4.宿主細胞CDK2活性對HSV染色體構(gòu)象的影響真核生物基因的轉(zhuǎn)錄活性與染色體的結(jié)構(gòu)狀態(tài)密切相關(guān)。我們推論上述HSV在CDK2活性下降細胞中的復(fù)制延遲可能與HSV染色體構(gòu)象有關(guān)。為驗證這一假設(shè),我們提取了5PFU/Cell的HSV感染Dox誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的HT29Tet-Ondn-CDK2細胞5小時后

11、的細胞核,用微球菌核酸酶(MCN)消化染色體,電泳分離后印漬到硝酸纖維素膜上,用HSV基因探針雜交,測定HSV基因組被MCN消化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSV在感染CDK2活性正常的HT29Tet-On dn-CDK2細胞5小時后基因組DNA被MCN作用5分鐘即被降解成DNA片斷,而感染CDK2活性下降的HT29Tet-On dn-CDK2細胞5小時后HSV基因組被MCN作用30min仍然沒有降解,表明HSV基因組DNA可能與組蛋白結(jié)合緊密,以致