1、幾丁聚糖(chitosan)，化學名為2-氨基-β-1,4-葡聚糖，分子式為：(C6H11O4N)n，是從幾丁動物外殼、低等植物菌類、藻類以及高等動物的細胞壁中提取出來的一種含有大量陽離子的葡萄糖胺多聚體。1811年法國科學家Braconnot首先從蘑菇中提取出幾丁質(zhì)并將其命名為Fungine。1823年，法國科學家歐吉爾在甲殼動物的外殼中也提取出幾丁質(zhì)并命名為chitin。1859年，魯凱特將幾丁質(zhì)置于氫氧化鈉溶液中加熱，制得一種可溶

2、解于有機酸的物質(zhì)；1894年，安波索拉將魯凱特制備的這種物質(zhì)命名為幾丁聚糖(chitosan)并沿用至今。 自發(fā)現(xiàn)幾丁聚糖以來，對它的研究不斷深入。1977年在美國波士頓召開了由MitSeaGrandProgram主辦的第一屆國際幾丁質(zhì)·幾丁聚糖學術(shù)會議，首次集中探討了幾丁質(zhì)的生產(chǎn)、開發(fā)及利用狀況；1982年，第二屆國際幾丁質(zhì)·幾丁聚糖會議于日本召開；亞洲也于1994年和1996年先后召開了兩屆幾丁質(zhì)·幾丁聚糖學術(shù)會議，并深入探

3、討了幾丁聚糖在醫(yī)藥、生物、食品、紡織工業(yè)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護諸領域的應用前景。近年來，隨著高分子科學和生物醫(yī)學工程的發(fā)展，幾丁聚糖在醫(yī)學方面的研究日益增多，并因其具有多種生理調(diào)節(jié)功能而被譽為除糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素與礦物質(zhì)外人體必需之第六生命要素。 環(huán)境重金屬鎘污染對人體的影響具有時效長、危害大、不易降解等特點，其致突變和致癌作用引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，并使得重金屬拮抗劑、解毒劑的尋找和開發(fā)成為環(huán)境衛(wèi)生領域研究的熱點。中國環(huán)境

4、衛(wèi)生學界著名教授陳學敏先生通過深入研究硒和鍺拮抗環(huán)境重金屬鎘的作用機制，建立了一整套較為完善的重金屬研究方法和學術(shù)思想，并發(fā)現(xiàn)硒、鍺等解毒劑的安全劑量范圍很窄，用量稍大即引起毒副作用，從而大大限制了該類解毒劑的應用。隨著研究領域的拓寬，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，幾丁聚糖對重金屬具有很強的吸附作用并將其用于環(huán)境重金屬污染的治理；Gyliene和Bhanoori通過研究發(fā)現(xiàn)，以幾丁聚糖作為鎘的生化吸附劑可有效促進鎘的代謝和排除。盡管這些研究只是剛剛開始

5、，但已凸顯出幾丁聚糖作為環(huán)境重金屬解毒劑的潛在價值。 本研究在采用Fenton反應產(chǎn)生羥自由基并證實幾丁聚糖對羥自由基清除作用的基礎上，以氯化鎘染毒HepG2細胞產(chǎn)生氧化損傷模型，檢測幾丁聚糖對細胞活力、ROS水平的影響，深入探討幾丁聚糖對DNA氧化損傷和損傷后修復的作用，以期初步闡明其作用機制。 第一部分幾丁聚糖對羥自由基的清除作用 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法研究幾丁聚糖對羥自由基的清除作用。以抗壞血酸作為陽

6、性對照，檢測不同濃度幾對聚糖對Fenton反應體系中羥自由基的清除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0.04mg/ml-0.32mg/ml濃度范圍內(nèi)，幾丁聚糖聚對羥自由基(·OH)的清除作用逐漸增強，最大清除率可達93.67％；幾丁聚糖對羥自由基有假陽清除現(xiàn)象，扣除假陽清除率后，仍呈現(xiàn)74.98％-84.64％的清除率。研究表明幾丁聚糖具有較強的羥自由基清除作用。 第二部分幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細胞氧化損傷的作用及機制研究 1.幾丁聚

7、糖對氯化鎘致HepG2細胞活力降低的影響 采用MTT試驗檢測氯化鎘對HepG2細胞的抑制作用及幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細胞活力降低的影響。 結(jié)果顯示：采用10μmol/L氯化鎘染毒HepG2細胞，其活力在所有染毒時間點(4h、8h、16h和24h)均無明顯降低；當氯化鎘濃度增加至20μmol/L和30μmol/L時，染毒4h后，細胞活力均有一定程度的降低，但與正常對照組相比無顯著性差異；當氯化鎘濃度增加至40μmol

8、/L和50μmol/L時，在所有染毒時間點上均可見細胞活力顯著降低(P＜0.05)固定染毒時間，HepG2細胞活力隨氯化鎘濃度的增加而降低，并呈現(xiàn)明顯的劑量-依賴關(guān)系。染毒時間為4h時，氯化鎘濃度由10μmol/L增加至50μmol/L，HepG2細胞活力從86.3％降至75.7％，僅40μmol/L和50μmol/L劑量組細胞活力與正常對照組有顯著性差異(P＜0.05)；當染毒時間分別延長至8h、16h和24h，除10μmol/L劑量

9、組細胞活力與正常對照組間無顯著性差異外，其余染毒組細胞活力與正常對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 20μmol/L氯化鎘染毒HepG2細胞24h后，細胞活力降至54.8％；在培養(yǎng)液中加入高濃度的幾丁聚糖(0.5mg/ml)，細胞活力未發(fā)生顯著性變化(與正常對照組相比：P＞0.05)；在氯化鎘染毒的同時，于培養(yǎng)液中加入不同濃度的幾丁聚糖后，HepG2細胞活力隨幾丁聚糖濃度的增加而增強，并且最高劑量幾丁聚糖(0.5mg/m

10、l)與氯化鎘聯(lián)合作用組細胞活力與氯化鎘單獨作用組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 2.幾丁聚糖對氯化鎘誘導HepG2細胞產(chǎn)生ROS的清除作用 研究不同濃度幾丁聚糖對氯化鎘誘發(fā)HepG2細胞產(chǎn)生ROS的清除作用。用氯化鎘誘發(fā)HepG2細胞產(chǎn)生ROS，以DCFH-DA作熒光探針，采用流式細胞檢測技術(shù)檢測幾丁聚糖與氯化鎘聯(lián)合作用下HepG2細胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：20μmol/L氯化鎘可使HepG2細胞內(nèi)ROS水平顯著增

11、加(P＜0.01)；以0.50mg/ml幾丁聚糖處理HepG2細胞后，細胞內(nèi)ROS水平較正常對照組略有降低，但并無顯著性差異；與氯化鎘染毒組相比，幾丁聚糖和氯化鎘聯(lián)合作用組細胞內(nèi)ROS水平隨幾丁聚糖濃度的增加逐漸降低，并且在高劑量幾丁聚糖(0.5mg/ml)和氯化鎘聯(lián)合作用組呈現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)。實驗表明，幾丁聚糖對HepG2細胞內(nèi)由氯化鎘誘發(fā)產(chǎn)生的ROS具有較好的清除作用。 3.幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細胞DN

12、A氧化損傷的影響 采用單細胞凝膠電泳技術(shù)，以代謝酶較為完整的人肝腫瘤(HepG2)細胞為靶細胞，研究氯化鎘致HepG2細胞DNA氧化損傷作用及幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細胞DNA氧化損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn)：(1)隨氯化鎘濃度的增加，HepG2細胞Olive尾矩值逐漸增大，并呈明顯的劑量-依賴關(guān)系；低濃度組(5μmol/L、10μmol/L)HepG2細胞Olive尾矩值與正常對照組相比無顯著性差異，但20μmol/L、40μmo

13、l/L和80μmol/L濃度組HepG2細胞Olive尾矩值均較正常對照組顯著增高(P＜0.01)；(2)幾丁聚糖對照組HepG2細胞DNA損傷較正常對照組略有減輕，但并無顯著性差異；分別以不同濃度幾丁聚糖與20μmol/L氯化鎘聯(lián)合作用時，HepG2細胞DNA損傷程度均較20μmol/L氯化鎘單獨作用組減輕，隨幾丁聚糖濃度的增加，DNA損傷逐漸減輕，呈現(xiàn)明顯的劑量-依賴關(guān)系；并且，在高劑量幾丁聚糖(0.50mg/ml)與氯化鎘聯(lián)合作用

14、組呈現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)。研究結(jié)果表明，幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細胞DNA損傷有一定的保護作用。 4.幾丁聚糖對鎘抑制HepG2細胞DNA修復酶hOGG-1表達的影響 在以往開展的硒對鎘引發(fā)氧自由基清除作用和幾丁聚糖對羥自由基清除作用研究的基礎上，進一步研究幾丁聚糖對氯化鎘抑制HepG2細胞DNA氧化損傷修復酶hOGG-1表達的影響。在氯化鎘染毒HepG2細胞的同時，于培養(yǎng)液中加入不同濃度的幾丁聚糖，采用W

15、estemblotting檢測氯化鎘單獨作用以及幾丁聚糖和氯化鎘聯(lián)合作用下HepG2細胞DNA氧化損傷修復酶hOGG-1的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)以40μmol/L氯化鎘染毒HepG2細胞24小時后，細胞內(nèi)hOGG-1表達顯著下降(P＜0.01)；幾丁聚糖對照組與正常對照組相比，hOGG-1表達無顯著性差異；(2)不同濃度幾丁聚糖和氯化鎘聯(lián)合作用組HepG2細胞hOGG-1的表達水平均較氯化鎘單獨作用組高，隨著幾丁聚糖濃度的增加，hO