1、第一部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞納米鐵顆粒標(biāo)記
　　目的:以超順磁氧化鐵納米顆粒標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)納米鐵標(biāo)記對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能的影響。
　　方法:取200-250gWistar大鼠，分離股骨和脛骨的骨髓后，以貼壁分離法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察生長(zhǎng)。取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞表面CD14、CD29、CD31、CD34、CD45、CD90分子表達(dá)情況。以超順磁氧化鐵

2、納米顆粒溶液(SPIO25ug/ml，PLL0.75ug/ml)標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，透射電鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記狀況。并將鈉米鐵顆粒標(biāo)記前后的間充質(zhì)干細(xì)胞分別進(jìn)行成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化，觀察納米鐵標(biāo)記對(duì)干細(xì)胞分化功能的影響情況。
　　結(jié)果:貼壁分離培養(yǎng)法可以順利分離并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，表面分子CD29、CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，不表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。納米

3、鐵標(biāo)記后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，電鏡下見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化，胞漿內(nèi)可見(jiàn)SPIO顆粒。標(biāo)記前后間充質(zhì)干細(xì)胞均具有良好成骨和成脂肪分化功能。
　　結(jié)論:含25ug/mlSPIO，0.75/mlPLL的超順磁氧化鐵標(biāo)記溶液可良好標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)干細(xì)胞表面分子表達(dá)及成骨、成脂肪等基本生物學(xué)功能無(wú)明顯影響。
　　第二部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞功能影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　第一節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖能力影響研究

4、r>　　目的:通過(guò)體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。
　　方法:以SD大鼠T淋巴細(xì)胞5×104個(gè)為反應(yīng)細(xì)胞，Wistar大鼠T淋巴細(xì)胞5×104個(gè)為刺激細(xì)胞，建立單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，反應(yīng)中另分別加入不同量Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。分組:A組:SD大鼠T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng);B組:SD大鼠T淋巴細(xì)胞+Wistar大鼠T淋巴細(xì)胞;C組:SD大鼠T淋巴細(xì)胞+Wistar大鼠T淋巴細(xì)胞+Wis

5、tar大鼠MSC細(xì)胞5×102個(gè);D組:SD大鼠T淋巴細(xì)胞+Wistar大鼠T淋巴細(xì)胞+Wistar大鼠MSC細(xì)胞5×103個(gè);E組:SD大鼠T淋巴細(xì)胞+Wistar大鼠T淋巴細(xì)胞+Wistar大鼠MSC細(xì)胞5×104個(gè)?；旌霞?xì)胞反應(yīng)72h后，H3摻入法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，
　　結(jié)果:混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)后，B、C、D、E各實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞明顯增殖，與A組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，加入干細(xì)胞的C、D、E各組T細(xì)胞增殖能力逐漸下降，組間有顯著差異

6、。
　　結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以抑制反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的增殖，這種抑制作用具有干細(xì)胞數(shù)量依賴性。
　　第二節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響研究
　　目的:通過(guò)體外混合細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的影響。
　　方法:同第一節(jié)分組方法建立體外混合細(xì)胞培養(yǎng)體系，細(xì)胞培養(yǎng)72h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CD4+CD25+T細(xì)胞比例，并計(jì)算各組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值。ELISA法檢

7、測(cè)各組培養(yǎng)上清液中IL-2，IL-4，IL-10，TGF-β1，IFN-γ水平。
　　結(jié)果:混合細(xì)胞反應(yīng)后，加入干細(xì)胞的C、D、E各組，CD4+CD25+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值逐漸增加，C、D、E各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B、C、D、E各組IL-2和IFN-γ水平逐漸下降，IL-4、IL-10、TGF-β1水平逐漸升高，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)中，可以提高CD4+C

8、D25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，及CD4+/CD8+細(xì)胞比值，這種作用具有劑量依賴性，與提高TGF-β1、IL-4、IL-10水平，降低IL-2、IFN-γ水平，促進(jìn)Th細(xì)胞分化向Th2方向偏移等因素有關(guān)。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注聯(lián)合胸腺注射誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植預(yù)處理方法誘導(dǎo)大鼠同種異體心臟移植免疫耐受的作用，并探討分子機(jī)制。
　　方法:建立雄性Wistar大鼠

9、至雌性SD大鼠同種異體腹腔異位心臟移植模型。在心臟移植前1周，分別取納米鐵標(biāo)記的供體Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行受體SD大鼠的胸腺內(nèi)注射和尾靜脈注射。實(shí)驗(yàn)分組:A組（對(duì)照組）:僅行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同種異位心臟移植;B組（靜脈注射組）:受體（SD大鼠）經(jīng)頸靜脈注射供體（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml，一周后行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同種異位心臟移植;C組（胸腺注射組）:受體（SD大鼠）胸腺內(nèi)

10、注射供體（Wistar大鼠）MSCs5×105/0.1ml，余同B組;D組（靜脈注射+胸腺注射組）:受體（SD大鼠）經(jīng)頸靜脈注射供體（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml，余同C組。觸診法觀察心臟移植物存活時(shí)間。移植后第1、3、5天分別取心臟移植物分離淋巴細(xì)胞，提取RNA，相對(duì)定量RT-PCR檢測(cè)各組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、miR-7a、miR-155、miR-182、miR-183、miR-434-3p

11、水平。分別取外周血，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細(xì)胞比例。PCR檢測(cè)受體內(nèi)供體SRY基因表達(dá)情況。MRI和普魯士藍(lán)染色檢測(cè)標(biāo)記干細(xì)胞在移植后的分布狀況。
　　結(jié)果:大鼠同種異體心臟移植后，B、C、D組移植物存活時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細(xì)胞比例逐步提高，第5天明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。移植后第1、3、5天miR-7a、miR-182、miR-183水平逐步升高，miR

12、-434-3p水平逐步降低，各時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但同一時(shí)間點(diǎn)各組差異不明顯。第3天和第5天B、C、D組miR-155水平增幅下降，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，D組有顯著差異。移植后第5天，IL-2、IFN-γ水平明顯下降，與對(duì)照組相比，B組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，C、D組有顯著差異;C、D組IL-4水平升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;D組IL-10水平升高，有顯著性差異。B、C組受體大鼠腹腔淋巴結(jié)均可見(jiàn)供體SRY基因表達(dá)。MRI和普魯士藍(lán)染色可見(jiàn)胸腺及移植心

13、臟內(nèi)標(biāo)記干細(xì)胞存留，數(shù)量逐漸減少。
　　結(jié)論:大鼠同種心臟移植后，受體miR-155，miR-182，miR-183和miR-7表達(dá)升高，miR-434-3p表達(dá)下降。胸腺內(nèi)注射供體MSCs和靜脈內(nèi)注射供體MSCs可以增加受體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，降低受體大鼠miR-155表達(dá)水平，提高移植物細(xì)胞因子IL-4，IL-10表達(dá)水平，降低IL-2、IFN-γ表達(dá)水平，并促進(jìn)供受體嵌合，延長(zhǎng)心臟移植物存活時(shí)間。胸腺注射和