1、食管下括約肌(Lower esophageal sphincter, LES)是位于食管胃結(jié)合部的約2-3厘米的特殊的增厚的環(huán)形肌束。1979年，Liebermann-Meffert首次提出了人食管下括約肌是由位于胃大彎側(cè)斜行的套索纖維（sling fibers）與胃小彎側(cè)的半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibres)共同構(gòu)成。鉤狀纖維，套索纖維與膈腳一起，在神經(jīng)，體液等多種因素調(diào)解下，保持持續(xù)收縮狀態(tài)，從而在食管胃交接部形成高壓帶，構(gòu)

2、成人體內(nèi)生理性抗返流屏障，防止胃內(nèi)容物的返流。
　　 食管下括約肌收縮和舒張的調(diào)節(jié)機(jī)制是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支配下，由多種神經(jīng)遞質(zhì)、激素和自身肌源性因素共同參與完成的。迷走神經(jīng)的輸出神經(jīng)末梢和食管下括約肌的腸道運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元共同構(gòu)成了抑制性和興奮性運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路。興奮性運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路由節(jié)前膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與節(jié)后膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元共同構(gòu)成。抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元由節(jié)前膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與節(jié)后非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)元共同構(gòu)成。興奮性或抑制性神經(jīng)通路的激

3、活導(dǎo)致膽堿能節(jié)后神經(jīng)元或腸道神經(jīng)元多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，正是通過這些釋放的神經(jīng)遞質(zhì)來實(shí)現(xiàn)對食管下括約肌收縮或舒張的調(diào)節(jié)。目前比較明確的是興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)通路的激活可以釋放乙酰膽堿和P物質(zhì)，從而引起食管下括約肌的收縮。抑制性傳導(dǎo)通路的激活，引起腸道神經(jīng)元釋放一氧化氮和血管活性腸肽等神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致食管下括約肌的舒張。
　　 研究表明，食管運(yùn)動(dòng)障礙性疾病如彌漫性食管痙攣、賁門失弛緩癥以及胡桃夾食管等疾病中均表現(xiàn)有食管下括約肌的異常。因此，

4、對于食管下括約肌調(diào)節(jié)機(jī)制的研究對食管運(yùn)動(dòng)障礙性疾病的診斷與治療有及其重要的意義。目前國內(nèi)外對于食管下括約肌的研究主要集中在一氧化氮，乙酰膽堿，血管活性腸肽以及P物質(zhì)等神經(jīng)遞質(zhì)，受體以及信號傳導(dǎo)通路。
　　 腎上腺素β受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，并發(fā)揮著極其重要的作用。腎上腺素β受體有β1、β2和β3受體三種亞型。研究表明，腎上腺素β受體廣泛地分布于動(dòng)物的胃腸道之中。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬

5、采用蛋白印跡法(Western-blot)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，電場刺激(Electrical field stimulation，EFS)以及離體肌張力測定技術(shù)等方法，對腎上腺素β受體在人食管下括約肌的表達(dá)及功能進(jìn)行研究，探討人腎上腺素β受體在人食管下括約肌調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步完善人食管下括約肌的調(diào)節(jié)機(jī)制，治療食管運(yùn)動(dòng)障礙性疾病提供理論依據(jù)。
　　 第一部分腎上腺素β受體在人食管下括約肌的表達(dá)規(guī)律

6、　　 目的:腎上腺素β受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族重要的受體之一。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白印跡法(Westem-blot)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究人食管下括約肌中的腎上腺素β受體三種亞型在套索纖維、鉤狀纖維、食管和胃底環(huán)形肌中的表達(dá)規(guī)律。
　　 方法:選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院自2011年1月到2011年10月因食管中段癌行食管大部切除術(shù)患者30例，其中男性患者24例，女性患者6例，平均年齡62歲。在手術(shù)室收集新鮮食管胃結(jié)合部

7、標(biāo)本，制備套索纖維、鉤狀纖維、胃底和食管環(huán)形肌肌條。提取組織總RNA，分別應(yīng)用三種腎上腺素亞型的引物行RT-PCR，用Gel Pro軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值(IOD)，用腎上腺素β亞型與β-actin的IOD的比值來表示肌條中mRNA的相對含量。提取組織總蛋白，將蛋白調(diào)整至相同濃度，電泳分離出腎上腺素β受體的各個(gè)亞型后轉(zhuǎn)膜，再分別應(yīng)用腎上腺素β受體的各個(gè)亞型抗體進(jìn)行孵育，經(jīng)Gel Pro軟件分析各反應(yīng)條帶的光密度值(IOD)。

8、　　 結(jié)果:紫外分光度計(jì)測定顯示，總RNA A260/A280比值為1.8-2.0。三種β受體亞型的mRNA在各肌條均有表達(dá):分別是β1-AR，β2-AR，β3-AR。β3-AR表達(dá)量最高，它在索纖維、鉤狀纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌表達(dá)水平分別為1.442±0.056;1.451±0.041;1.471±0.027;1.432±0.054;β1-AR表達(dá)水平次之，依次為1.129±0.044;1.137±0.049;1.126±0.

9、043;1.120±0.053;β2-AR表達(dá)量最低，依次為0.469±0.038;0.465±0.032;0.469±0.042;0.460±0.060;在同一種肌條中，三種受體亞型的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4100，P=0.00).。同一種受體亞型，在各肌條間mRNA的表達(dá)無差異(F=0.78，P=0.30)。同一種受體亞型，在各肌條間mRNA的表達(dá)無差異(F=0.78，P=0.30)。三種β受體受體亞型均有其相應(yīng)蛋白條帶的表達(dá):分

10、別是β1-AR，β2-AR，β3-AR。β3-AR表達(dá)量最高，它在套索纖維、鉤狀纖維、食管平滑肌和胃底平滑肌表達(dá)水平分別為0.526±0.017;0.510±0.013;0.524±0.014;0.535±0.016;β1-AR表達(dá)水平次之，依次為0.399±0.014;0.386±0.019;0.383±0.017;0.386±0.024;β2-AR表達(dá)量最低，依次為0.162±0.132;0.151±0.014;0.164±0.01

11、6;0.152±0.016;在同一種肌條中，三種受體亞型的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=39，P=0.00）。同一種受體亞型，在各肌條間蛋白的表達(dá)無差異（F=0.30，P=0.54）
　　 結(jié)論:人LES中存在著三中腎上腺素β亞型，分別是腎上腺素β1-AR，β2-AR，β3-AR。其表達(dá)水平依次是β3-AR＞β1-AR＞β2-AR?？赡茉谌薒ES的功能調(diào)解中發(fā)揮著作用。
　　 第二部分腎上腺素β受體在人食管下括約肌調(diào)節(jié)機(jī)制的作

12、用
　　 目的:研究非選擇性的腎上腺素β受體激動(dòng)劑和拮抗劑以及選擇性的腎上腺素β受體激動(dòng)劑和拮抗劑對人離體LES肌條的作用，探討腎上腺素β受體在人LES收縮和舒張調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用。
　　 方法:選取2011年10月至2012年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院胸三科因食管中段癌行食管大部分切除的患者共30例，其中男性20例，女性10例，平均年齡63歲。在手術(shù)室采取新鮮食管胃結(jié)合部標(biāo)本立即放入4℃ Krebs中，沖洗干凈的標(biāo)本

13、粘膜面向上固定在盛有Krebs液體的蠟盤中，并持續(xù)通有含5％CO和95％O2的氣體。沿胃大彎側(cè)切開標(biāo)本，銳性剝離賁門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層，發(fā)現(xiàn)位于食管胃交界處的發(fā)白增厚的肌環(huán)即為食管下括約肌，肉眼識(shí)別出套索纖維與鉤狀纖維。套索纖維位于標(biāo)本的兩端并呈斜行分布，而鉤狀纖維則位于標(biāo)本的中央。游離鉤狀纖維和套索纖維，制備成(2～4) mm×(8～12)mm的肌條。
　　 用絲線扎緊肌條兩端，置于含Krebs液37℃恒溫的10毫

14、升浴槽中，并持續(xù)通以含5％CO和95％O2的氣體。肌條上端與JZ101型肌肉張力換能器固定，經(jīng)由Medlab信號采集器記錄肌條的張力變化情況。緩慢牽拉肌條使之張力穩(wěn)定于200mg，此時(shí)的肌條長度即為初始長度L0.然后多次緩慢牽拉肌條，每次增加長度約為初始長度的25％左右，直至肌條長度拉伸至初長度的200％作為最適初長度。
　　 待肌條最適初長度穩(wěn)定約30分鐘后，然后以濃度累計(jì)方式分別向恒溫浴槽中加入非選擇性的腎上腺素β受體激動(dòng)劑

15、以激活各受體亞型。給藥濃度為(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L)。觀察給藥后肌條張力的變化情況，待張力穩(wěn)定后再增加一個(gè)濃度，每次加藥前都要等前一濃度達(dá)到最大反應(yīng)且穩(wěn)定后再加入下一濃度藥物。每次加藥與前一濃度穩(wěn)定的時(shí)間間隔為10分鐘。據(jù)此繪制累計(jì)給藥的濃度-反應(yīng)量效曲線。觀察拮抗劑效應(yīng)時(shí)，在加入激動(dòng)劑前30分鐘，加入拮抗劑，拮抗劑的濃度與激動(dòng)劑誘導(dǎo)肌條產(chǎn)生最大效應(yīng)的激動(dòng)劑濃度相同。選擇性的β

16、-AR受體激動(dòng)劑，選擇性的β-AR拮抗劑的加藥方法同前。藥物誘發(fā)的肌條反應(yīng)以肌條收縮或舒張的百分比的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±SE)來表示。
　　 結(jié)果:
　　 1、非選擇性腎上腺素β受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素在10-4mol/L的濃度可以誘導(dǎo)人食管下括約肌肌條產(chǎn)生舒張效應(yīng)。應(yīng)用非選擇性的腎上腺素β受體阻滯劑心得安對異丙腎上腺素產(chǎn)生的舒張作用無效。但此作用可以被選擇性腎上腺素β3受體選擇性拮抗劑L748337所阻斷。
　　

17、 2、選擇性的腎上腺素β1受體激動(dòng)劑多巴酚丁胺和β2受體激動(dòng)劑沙丁胺醇對食管下括約肌肌條均沒有作用。選擇性的腎上腺素β3受體激動(dòng)劑BRL37344在（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、104mol/L）濃度下可以誘導(dǎo)人食管下括約肌肌條產(chǎn)生濃度依賴性的舒張效應(yīng)，在10-4 mol/L時(shí)，肌條均達(dá)到最大收縮百分比，為（（80.4±0.6））％。應(yīng)用選擇性的腎上腺素β3受體拮抗劑L748337后，BRL37344誘導(dǎo)肌條產(chǎn)生

18、收縮的能力明顯下降，肌條均達(dá)到最大收縮百分比，為（54.6±0.5）％。應(yīng)用拮抗劑前后兩肌條間收縮效應(yīng)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、非選擇性腎上腺素β受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素在10-4mol/L的濃度可以誘導(dǎo)人食管下括約肌肌條產(chǎn)生舒張效應(yīng)。應(yīng)用非選擇性的腎上腺素β受體阻滯劑心得安對異丙腎上腺素產(chǎn)生的舒張作用無效。但此作用可以被腎上腺素β3受體選擇性拮抗劑L748337所阻斷。提示腎上腺素β1和

19、β2受體可能沒有參與對人食管下括約肌的調(diào)節(jié)作用，腎上腺素β3可能參與了對人食管下括約肌的調(diào)節(jié)。
　　 2、選擇性的腎上腺素β1受體激動(dòng)劑多巴酚丁胺和β2受體激動(dòng)劑沙丁胺醇對離體食管下括約肌肌條無作用。選擇性的腎上腺素β3受體激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)人食管下括約肌肌條產(chǎn)生濃度依賴性的舒張效應(yīng)，選擇性的腎上腺素β3受體拮抗劑L748337可阻斷BRL37344的作用。進(jìn)一步提示腎上腺素β1和β2受體可能沒有參與對人食管下括約肌的調(diào)節(jié)作用，腎上

20、腺素β3可能參與了對人食管下括約肌的調(diào)節(jié)。
　　 第三部分腎上腺素β受體在電場刺激引起的人食管下括約肌反應(yīng)中的作用
　　 目的:研究選擇性腎上腺素β受體拮抗劑在電場刺激下對人食管下括約肌的作用，探討腎上腺素β受體在人食管下括約肌舒張調(diào)節(jié)中的作用。
　　 方法:選取2012年3月到2012年12月在河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸三科因食管中上段癌，行食管大部分切除的患者30例，其中男性25例，女性5例，平均年齡60歲。

21、食管下括約肌肌條的制備方法同前。將肌條置于37℃恒溫含Krebs液的10毫升浴槽中，并持續(xù)通以含5％CO2和95％O2的氣體。肌條的上端與肌肉張力換能器相連，下端固定于帶有鉑金電極的L形固定架上，利用Medlab信號采集器記錄肌條的張力變化情況。肌肉張力信號經(jīng)Medlab信號采集系統(tǒng)采集。牽拉肌肉至最適初長度方法同前。然后在持續(xù)通以含有5％CO2和95％O2的混合氣體的Krebs液中再次溫浴1小時(shí)。
　　 EFS刺激參數(shù):單脈沖

22、方波，波寬5ms，電壓50v,頻率1-512Hz以倍數(shù)遞增。加入阿托品后，按頻率從小到大行EFS，計(jì)算刺激后產(chǎn)生的最大效應(yīng)。刺激停止后待肌條回復(fù)平衡后，分別加入河豚毒素，選擇性的腎上腺素β1受體拮抗劑Nebivolol，選擇性的β2受體拮抗劑ICI118551和選擇性的β3受體拮抗劑L-748337，在加藥20分鐘后再給予EFS。EFS誘發(fā)的肌條反應(yīng)均以肌條的收縮或舒張百分比的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±SE)來表示。
　　 結(jié)果:<

23、br>　　 1、EFS可以誘導(dǎo)食管下括約肌（鉤狀纖維和套索纖維），產(chǎn)生頻率依賴性舒張反應(yīng)，最大舒張電刺激頻率為64HZ。EFS誘導(dǎo)食管下括約肌舒張的最大舒張百分比為（22.1±0.4）％。
　　 2、河豚毒素能明顯降低EFS引起的人食管下括約肌頻率依賴性舒張比較用藥前后肌條的舒張效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3、EFS誘導(dǎo)產(chǎn)生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張反應(yīng)，選擇性β1受體拮抗劑Nebivolol(P＞0

24、.05)和選擇性的β2受體拮抗劑ICI118551(P＞0.05)對其無抑制效應(yīng)，比較用藥前后舒張效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選擇性的β3受體拮抗劑L-748337對EFS引起的人食管下括約肌產(chǎn)生的頻率依賴性舒張反應(yīng)有抑制作用，用藥前后舒張反應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、河豚毒素能明顯降低EFS引起的人食管下括約肌頻率依賴性舒張。比較用藥前后肌條的舒張效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示EFS誘導(dǎo)產(chǎn)生的人食管下括約肌

25、頻率依賴性舒張是神經(jīng)來源的。
　　 2、EFS誘導(dǎo)產(chǎn)生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張反應(yīng)，選擇性的腎上腺素β1受體拮抗劑Nebivolol和選擇性的β2受體拮抗劑ICI118551對其無舒張效應(yīng)，比較用藥前后舒張效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選擇性的β3受體拮抗劑L-748337對EFS引起的人食管下括約肌產(chǎn)生的頻率依賴性舒張反應(yīng)有抑制作用，用藥前后舒張反應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示EFS誘導(dǎo)產(chǎn)生的人食管下括約肌頻率依賴性舒張可能有腎上腺素β3受體