1、油菜籽是世界第三大油料作物，我國的年產(chǎn)量在1100-1200萬t之間。油菜籽制油后，產(chǎn)生55％左右的菜籽餅粕，菜籽粕中含40％左右蛋白質(zhì)。菜籽蛋白的營養(yǎng)價(jià)值、消化率等高于大豆蛋白。但因存在硫甙等有毒物質(zhì)、多酚、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，菜籽蛋白利用不充分。多酚、植酸在食品及其他領(lǐng)域有著廣泛的用途，從植物多酚中篩選功能食品或藥品成分是近年研究的熱點(diǎn)。本文研究了菜籽粕綜合提取工藝，使菜籽粕中的蛋白質(zhì)、多酚、植酸、多糖等都可開發(fā)利用，并開發(fā)了用大孔樹

2、脂初步純化菜籽多酚的工藝，該工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)。用SephadexLH-20柱色譜分離菜籽多酚，通過UV-vis光譜、IR光譜、HPLC-DAD-ESI-MS/MS等手段對菜籽多酚中部分成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。菜籽多酚有兩種利用方式：作為天然食品抗氧化劑與作為功能食品的活性成分。這兩種利用方式都需要明確其抗氧化能力。本文從化學(xué)模擬體系、體外、體內(nèi)三個(gè)層次研究菜籽多酚的抗氧化作用與機(jī)理，并對其劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了探討。按照自由基理論，抗氧化

3、的成分可能具有防治多種人體疾病的作用，為此，評價(jià)了菜籽多酚對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的抑制作用、在荷S180瘤小鼠體內(nèi)抑制腫瘤的作用、在四氧嘧啶致糖尿病小鼠體內(nèi)的降血糖作用。對試驗(yàn)中得到的菜籽多糖，也研究了其抗氧化作用與機(jī)理、在荷S180瘤小鼠體內(nèi)抑制腫瘤的作用、在四氧嘧啶致糖尿病小鼠體內(nèi)的降血糖作用。 主要研究內(nèi)容如下： 1菜籽粕分步提取菜籽多酚、植酸綜合提取工藝優(yōu)化 1)分步提取菜籽多酚、植

4、酸綜合提取工藝的優(yōu)化以提取率與提取過程對植酸與多酚的分離程度為指標(biāo)，篩選出兩種溶劑系統(tǒng)A與B，用A、B依次提取華雜4號油菜籽冷榨粕的多酚及植酸，能實(shí)現(xiàn)多酚、植酸與蛋白質(zhì)的綜合利用。優(yōu)化出多酚提取工藝并建立了預(yù)測多酚與植酸提取率的數(shù)學(xué)模型。 2)大孔樹脂初步純化菜籽多酚用8種國產(chǎn)大孔樹脂對菜籽多酚進(jìn)行了靜態(tài)吸附與解析試驗(yàn)，結(jié)果表明，特1號樹脂最適于純化菜籽多酚。通過動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)測定了特1號樹脂吸附菜籽多酚的泄漏點(diǎn)與飽和點(diǎn)，結(jié)果表明

5、，采用串柱法有利于樹脂吸附能力的發(fā)揮。動(dòng)態(tài)解析試驗(yàn)表明，蒸餾水能較好地洗脫菜籽多酚中的雜質(zhì)；用74％(v/v)酸性乙醇(含5％(v/v)的0.1mol/LHCl)，以1BV/h的流速洗脫，最適合于工業(yè)生產(chǎn)中解吸菜籽多酚(RSPP)。 2菜籽多酚的結(jié)構(gòu)鑒定將RSPP上SephadexLH-20柱，依次用水/甲醇/丙酮混合溶液洗脫，得到的級分依次記為RSPP-0、RSPP-1、RSPP-2、RSPP-3、RSPP-4、RSPP-5、

6、RSPP-6、RSPP-7。從RSPP-1到RSPP-5，以及RSPP-7在330nm附近以及270-282.6nm有吸收峰。330nm附近的吸收峰，反應(yīng)可能存在酚酸。270-282.6nm的吸收峰，反映對—羥基安息香酸、單寧、黃酮、黃酮醇中的一種或幾種存在。各樣品的紅外光圖譜與文獻(xiàn)報(bào)道的兒茶素等單寧的圖譜較為相近，圖譜顯示出羥基、苯環(huán)等結(jié)構(gòu)信息，菜籽多酚結(jié)構(gòu)中有與縮合單寧相近的部分。HPLC-DAD表明，ODSC18柱(5μm,25c

7、m×4.6mmI，d)能較好分離菜籽多酚，各主要峰的紫外—可見光譜顯示酚酸、單寧、黃酮等的吸收特征。 3菜籽多酚的功能活性 1)菜籽多酚的抗氧化作用與機(jī)理測定了各RSPP在化學(xué)模擬體系、小鼠線粒體、大鼠及小鼠紅細(xì)胞、小鼠血清與肝勻漿及小鼠體內(nèi)的抗氧化作用。結(jié)果表明：在化學(xué)反應(yīng)體系中，以上物質(zhì)皆具有還原能力，能清除活性氧，能夠抑制脂肪氧合酶的活性。說明高的還原能力與能抑制生物體內(nèi)氧化酶是它們抗氧化的機(jī)理。在體外實(shí)驗(yàn)中，各R

8、SPP能抑制線粒體膜的腫脹，抑制大鼠紅細(xì)胞自氧化溶血與H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血，增加小鼠血清抗活性氧能力，抑制小鼠肝線粒體、大鼠紅細(xì)胞、小鼠肝組織勻漿MDA的生成。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，腹膜注射RSPP組小鼠與對照組相比，肝勻漿MDA的降低達(dá)到極顯著水平。以上實(shí)驗(yàn)表明：各RSPP在生物體內(nèi)具有明顯的抗氧化作用。 2)菜籽多酚對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的抑制作用MTT試驗(yàn)表明，25400μg/mLRSPP可顯著抑制體

9、外培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞增殖，并表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系與時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，400μg/mLRSPP處理3d對SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制率可達(dá)70.18％。PCNA的檢測結(jié)果能驗(yàn)證MTT試驗(yàn)的結(jié)論。對SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與AFP檢測表明，RSPP能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，降低SMMC-7721細(xì)胞的惡性程度。流式細(xì)胞儀檢測SMMC-7721細(xì)胞的結(jié)果表明，RSPP能阻止SMMC-7721細(xì)胞向S

10、期轉(zhuǎn)變，因阻斷細(xì)胞周期而阻止SMMC-7721細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測不出細(xì)胞凋亡的亞二倍體峰，表明RSPP不能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。 從試驗(yàn)結(jié)果分析，RSPP阻止SMMC-7721細(xì)胞增殖可能的機(jī)理有2條，一是影響SMMC-7721細(xì)胞周期，二是誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。 3)菜籽多酚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的抑瘤作用與增強(qiáng)免疫力作用通過接種S180細(xì)胞復(fù)制荷S180瘤小鼠模型。10d后處死小鼠

11、。稱重法測量小鼠腫瘤及臟器指數(shù)，結(jié)果表明：腹膜注射菜籽多酚RSPP、RSPP-1、RSPP-3對荷S180瘤小鼠均表現(xiàn)出抑瘤作用，50～200mg/Kg·d劑量的RSPP抑瘤率在30.23％～44.19％之間，50mg/Kg·d劑量的RSPP-1與RSPP-3分別為39.53％與32.56％。對小鼠腫瘤進(jìn)行HE染色，組織病理學(xué)觀察表明，經(jīng)菜籽多酚處理后小鼠腫瘤組織細(xì)胞核濃縮、炎性細(xì)胞浸潤、中性粒細(xì)胞崩解等現(xiàn)象發(fā)生程度明顯高于腫瘤對照組，

12、腫瘤細(xì)胞死亡面積大于對照組，證明菜籽多酚具有抗腫瘤作用，且能通過提高機(jī)體免疫力而發(fā)揮抑瘤作用。 小鼠免疫器官稱重結(jié)果表明，RSPP、RSPP-1、RSPP-3均能顯著提高荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率與吞噬指數(shù)、遲發(fā)性超敏反應(yīng)，脾細(xì)胞抗體形成等指標(biāo)，但只有高濃度RSPP能顯著升高小鼠血清溶血素含量，表明菜籽多酚能增進(jìn)荷瘤小鼠免疫力。增進(jìn)小鼠免疫力可能是菜籽多酚抑制腫瘤的機(jī)理之一。 4)菜籽多酚在四氧嘧啶致糖尿病小鼠

13、體內(nèi)的降血糖作用腹膜注射200mg/Kg四氧嘧啶造小鼠糖尿病模型，測定給藥前后小鼠血糖值，腹膜注射RSPP12d，75與400mg/Kg·d劑量可分別降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖值17.99％與24.14％，400mg/Kg·d菜籽多酚對正常小鼠體內(nèi)血糖值無影響。表明菜籽多酚不會引起正常小鼠低血糖，對糖尿病小鼠有一定降血糖作用。 4菜籽多酚提取副產(chǎn)物—菜籽多糖功能活性評價(jià) 1)菜籽多糖的抗氧化作用與機(jī)理用K3[Fe(CN

14、)6]與TCA體系、脂肪氧合酶評價(jià)菜籽多糖的還原能力及抑制脂肪氧合酶的能力，用丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)試劑盒測定MDA及ROS含量，用分光光度法測定小鼠肝線粒體腫脹度。結(jié)果顯示，在化學(xué)模擬體系中，RSPS具有還原能力，2.00mg·mL-1RSPS的抗活性氧單位為94.03，對脂肪氧合酶的抑制率達(dá)22.8％。在體外，0.05mg·mL-1RSPS對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的抑制作用達(dá)35.3％。2.00mg·mL-1RSPS

15、小鼠肝線粒體腫脹度低于非誘導(dǎo)組，對小鼠肝線粒體MDA生成抑制率達(dá)30.3％，對肝組織勻漿MDA生成抑制率分別為54.7％(非誘導(dǎo)組)、32.0％(Fe2+誘導(dǎo)組)及84.5％(H2O2誘導(dǎo)組)。10.00mg·mL-1RSPS使小鼠血清抗活性氧單位達(dá)1340.13，對大鼠紅細(xì)胞自氧化溶血及MDA生成的抑制率分別為31.4％與50.8％。在體內(nèi)，腹膜注射RSPS組小鼠(400mg·kg-1bw·d～，12d)與對照組相比，肝勻漿MDA的降

16、低達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。以上結(jié)果表明：RSPS在體內(nèi)外均具有明顯的抗氧化作用,RSPS具有還原能力及能抑制與氧化有關(guān)的酶的活性可能是其抗氧化的機(jī)理。 2)菜籽多糖在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的抑瘤作用與增強(qiáng)免疫力作用通過在小鼠右前腋接種S180細(xì)胞，復(fù)制荷S180瘤小鼠模型。10d后處死小鼠。小鼠瘤塊稱重結(jié)果表明，腹膜注射RSPS對荷S180小鼠均表現(xiàn)出抑瘤作用，50～200mg/Kg·d劑量的RSPS抑瘤率在20.66％～

17、34.710％之間。 RSPS能抑制荷S180瘤小鼠體內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶之一—LDH的活性，對抗氧化酶—CAT活性有顯著影響，能顯著降低小鼠血清中MDA含量，提示抑制LDH活性與清除自由基可能是其抑制腫瘤的機(jī)理。 3)菜籽多糖在四氧嘧啶致糖尿病小鼠體內(nèi)的降血糖作用腹膜注射200mg/Kg四氧嘧啶造小鼠糖尿病模型，給藥12d。測定給藥前后小鼠血糖值，結(jié)果表明，腹膜注射RSPS可降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠的血糖值，75與400mg