1、【研究背景】:
　　炎癥反應(yīng)是擁有循環(huán)系統(tǒng)的真核生物體針對(duì)內(nèi)源性或外源性有害刺激的一種綜合防御反應(yīng)的總稱,這些有害刺激物包括病原體、自身受損細(xì)胞和其他刺激物。這是機(jī)體嘗試清除這些有害刺激,清除和吸收壞死組織和細(xì)胞并進(jìn)行損傷修復(fù)的過程,屬于天然免疫的范疇。但過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷。肺部炎癥反應(yīng)的失調(diào)會(huì)引起肺血管滲透性增加,炎癥細(xì)胞肺侵潤增加,雖然這樣可以增強(qiáng)肺泡對(duì)外來細(xì)菌的清除能力,但也同時(shí)引起肺損傷(LI)。
　　慢性

2、氣道炎癥是COPD發(fā)病的核心內(nèi)容,其形成機(jī)制十分復(fù)雜,涉及多種炎性細(xì)胞。在COPD模型小鼠肺的不同部位均發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增加。現(xiàn)有證據(jù)表明香煙或污染空氣中的有害物質(zhì)刺激氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等釋放大量炎癥因子如TNF-α、IL-8、蛋白酶類等,這些介質(zhì)能促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)和(或)破壞氣道和肺組織結(jié)構(gòu),造成慢性氣道炎癥。
　　TGF-β的家族和人類的多種疾病有關(guān),如腫瘤、炎癥、組織纖維化等。在這些疾病

3、中,TGF-β呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞功能,其中包括TGF-β在炎癥過程中的抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)在OVA引起的過敏性氣道炎癥中,TGF-β的信號(hào)通路是活躍的。另外有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1參與了氣道炎癥疾病,如慢性鼻竇炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等,的炎癥和氣道重構(gòu)的發(fā)病過程,參與了炎癥的免疫調(diào)節(jié)和纖維增生調(diào)節(jié)。在炎癥的發(fā)病過程中,TGF-β1通過smad和非smad通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的功能,如Th2、Th17,特別是Treg細(xì)胞,從而抑制T細(xì)胞的活性,

4、下調(diào)炎癥的反應(yīng)。
　　骨形成蛋白-4(BMP4)是一種分泌型蛋白,在結(jié)構(gòu)上屬于TGF-β家族的成員,在調(diào)節(jié)胚胎期肺組織的成長和氣管支氣管的分化中起重要的作用。在成人,有研究證明BMP4在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中起促進(jìn)炎癥發(fā)病的作用。原位雜交試驗(yàn)表明,在成人的氣道BMP4表達(dá)于上皮細(xì)胞、氣道粘膜下層細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞聚集處。但另有研究發(fā)現(xiàn)BMP4在成人哮喘病人的過敏性氣道炎癥中表達(dá)基本無變化,隨后的研究發(fā)現(xiàn)BMP4能促進(jìn)間葉細(xì)胞和氣道上

5、皮細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化,在1-NN導(dǎo)致的肺炎癥損傷模型中有利于機(jī)體抵抗炎癥造成的損傷,并能增加氣道上皮細(xì)胞的遷移能力,有利于炎癥損傷的修復(fù);BMP4在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中具有促進(jìn)肺血管重構(gòu)的作用。但目前關(guān)于BMP4在急性氣道炎癥以及COPD發(fā)生發(fā)展中的作用還不清楚。
　　【研究目的】:
　　本論文研究探討骨形成蛋白-4(Bone Morphogenetic Protein 4,BMP4)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性氣道炎癥中的表達(dá)改變及

6、功能;探討B(tài)MP4在香煙煙霧誘導(dǎo)的慢性氣道炎癥過程中的表達(dá)改變及功能。
　　【研究方法】:
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　①、LPS(7.5μg/50μl生理鹽水)或者生理鹽水(正常對(duì)照組)滴鼻處理C57小鼠。處理后于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,取支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid),統(tǒng)計(jì)其中細(xì)胞總數(shù)和分類細(xì)胞數(shù),并用ELISA方法檢測(cè)其中TNF-a、KC等炎癥因子的水平。用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)肺組織總蛋白中BMP4的蛋白水平。同

7、時(shí)觀察經(jīng)HE染色的肺組織病理切片中炎癥以及肺組織損傷情況。
　?、?、LPS(7.5μg/50μl生理鹽水)滴鼻處理BMP4野生型(BMP4+/+)和基因半敲除小鼠(BMP4+/-),48小時(shí)后處死小鼠,并比較兩組小鼠以下參數(shù)的差異:支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類細(xì)胞類型及數(shù)量、支氣管肺泡灌洗液中TNF-a和KC水平、肺組織中BMP4蛋白水平及肺部炎癥和肺組織損傷情況。
　?、邸~綠假單胞菌(PA)(1×105或者1×106

8、CFU/小鼠,5只/組)滴鼻感染BMP4+/+和BMP4+/-小鼠,12小時(shí)后觀察小鼠肺中PA的清除率。
　　④、香煙煙霧誘導(dǎo)的方法建立慢性氣道炎癥模型(COPD模型),觀察模型的肺功能改變,支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的分類計(jì)數(shù),ELISA方法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中KC和肺組織中Muc5AC水平,肺組織切片PAS染色觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞的增生和分化情況。
　　2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　?、?、LPS刺激16HBE細(xì)胞和小鼠氣道上

9、皮細(xì)胞,ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中BMP4蛋白的表達(dá)水平和RT-PCR方法檢測(cè)BMP4RNA的表達(dá)水平。
　?、凇⑻崛⌒∈蟾骨痪奘杉?xì)胞(BMP4+/+小鼠和BMP4+/-小鼠),LPS刺激后ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中炎癥介質(zhì)水平的差異。
　　③、LSP和TNF-a刺激小鼠氣道上皮細(xì)胞,加用或不加用外源性BMP4重組蛋白預(yù)處理,ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中炎癥介質(zhì)水平的差異。
　?、堋SE刺激NCH292細(xì)胞,加用或不加

10、用外源性BMP4重組蛋白預(yù)處理,ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中Muc5AC的表達(dá)量的差異以及檢測(cè)Muc5AC的RNA表達(dá)水平的差異。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】:
　　一、BMP4在LPS誘導(dǎo)的急性炎癥過程中的表達(dá)變化及功能
　　1、BMP4在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性氣道炎癥過程中表達(dá)增加。和正常對(duì)照組相比較,在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性氣道炎癥模型中,支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)增加,增加的細(xì)胞中以白細(xì)胞為主,炎癥介質(zhì)TNF-a和

11、KC均較正常組增加(P均<0.05)。在炎癥過程BMP4的前體蛋白和成熟體蛋白水平在炎癥早期(12h)就開始增加,并一直持續(xù)到炎癥晚期(168h)。
　　2、在16HBE和小鼠氣道上皮細(xì)胞中,LPS刺激能引起B(yǎng)MP4的表達(dá)上調(diào)。BMP4蛋白的表達(dá)隨著LPS的濃度的增加而增加(P<0.05),并在LPS刺激早期(3h)開始增加。而BMP4的RNA表達(dá)水平也同樣增加。
　　3、LPS誘導(dǎo)的急性氣道炎癥在BMP4+/-小鼠中表現(xiàn)的

12、更加嚴(yán)重。和BMP4+/+小鼠相比較,LPS刺激誘導(dǎo)后,BMP4+/-小鼠炎癥更重,表現(xiàn)為BALF中細(xì)胞總數(shù),中性粒細(xì)胞,TNF-a和KC水平等的增多(P均<0.05),以及肺組織病理切片HE染色也顯示肺組織炎癥細(xì)胞浸潤在BMP4+/-小鼠中更嚴(yán)重。
　　4、BMP4+/-小鼠對(duì)PA菌的清除能力較BMP4+/+小鼠增強(qiáng)。PA菌感染12小時(shí)后,BMP4+/+小鼠肺組織中的細(xì)菌菌落數(shù)約為BMP4+/-小鼠中的3倍(P<0.05)。

13、r>　　5、分離自BMP4+/-小鼠腹腔的巨噬細(xì)胞,在LPS刺激后產(chǎn)生炎癥因子TNF-a和KC,其水平較來自于BMP4+/+小鼠的高(P<0.05)。
　　6、外源性BMP4重組蛋白能抑制LPS或者TNF-a誘導(dǎo)的小鼠氣道上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)KC的釋放。在小鼠氣道上皮細(xì)胞,LPS或者TNF-a刺激后,KC大量釋放,但是用外源性BMP4重組蛋白預(yù)處理后能使LPS或者TNF-a刺激誘導(dǎo)的KC的釋放水平下降(P<0.05)。
　　二、

14、BMP4在香煙煙霧誘導(dǎo)的慢性氣道炎癥過程中的表達(dá)變化及功能
　　1、用單純熏煙方法成功建立了慢性氣道炎癥(COPD)小鼠模型,其肺功能檢測(cè)顯示:氣道阻力顯著增加,肺順應(yīng)性、彈性增加,結(jié)果較正常組小鼠相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且光鏡下觀察模型組小鼠肺組織的病理改變可見:支氣管粘膜和肺實(shí)質(zhì)中均有大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺組織肺泡結(jié)構(gòu)大小不一,部分肺泡間隔斷裂,肺泡融合,肺泡腔擴(kuò)大,呈現(xiàn)出典型的肺氣腫病理改變。模型組小鼠的體重較正常對(duì)照組明顯

15、下降(P<0.05)。和BMP4+/+小鼠模型組相比較,BMP4+/-小鼠模型組的肺組織病理顯示炎癥細(xì)胞浸潤和肺組織的破壞更嚴(yán)重,但是肺功能和體重的改變兩組間沒有明顯的差異。
　　2、BMP4+/+小鼠模型組的BMP4成熟體蛋白和前體蛋白的表達(dá)均較正常組增加。
　　3、熏煙后模型組的BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞均較正常組增高。而BMP4+/-小鼠模型組和BMP4+/+小鼠模型組相比較中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增多。
　　4、BM

16、P4+/-小鼠接受香煙煙霧暴露刺激后,出現(xiàn)更顯著的氣道杯狀細(xì)胞的增生以及肺Muc5AC蛋白表達(dá)上調(diào)。熏煙后引起模型小鼠的氣道上皮杯狀細(xì)胞的增生,肺組織中的Muc5AC的表達(dá)增加,此種情況在BMP4+/-小鼠中尤為明顯。
　　5、外源性BMP4重組蛋白能抑制香煙煙霧提取物(CSE)誘導(dǎo)的NCH292細(xì)胞的Muc5AC的表達(dá)。在NCH292細(xì)胞,CSE刺激后,Muc5AC的表達(dá)上調(diào),但是用外源性BMP4重組蛋白預(yù)處理后能使CSE刺激誘