1、先天性巨結腸癥(Hirschsprung disease，HSCR)是一種先天性腸道神經節(jié)細胞缺乏癥，又稱無神經節(jié)細胞癥(Aganglionosis)，1886年丹麥醫(yī)生HaraldHirschsprung首先提出其特發(fā)性的先天病理改變，1945年Swenson對HSCR作出了根本性論斷，即病變腸管肌間神經叢中神經節(jié)細胞缺如，腸管不能舒張如"痙攣"腸管，其近段腸管繼而增大。HSCR是小兒外科常見的消化道畸形，在先天性消化道畸形中發(fā)病率居

2、第二位，發(fā)病率約為1/5000～1.76/10000，男女比例約為4：1，男性多見。 HSCR 的病因和發(fā)病機制目前尚不明確，普遍認為是多種因素共同作用的結果，如缺血、缺氧、病毒、毒素、遺傳等。各種因素作用于神經發(fā)育不同階段，抑制了神經節(jié)細胞的發(fā)育?？筛爬ㄒ韵氯N情況：1、神經嵴細胞遷移障礙。胚胎期神經嵴細胞分化及向腸壁內移行停頓所致。認為是一種多基因遺傳疾病，相關基因突變或/和表達異常使神經嵴細胞發(fā)育、遷移受阻而發(fā)生HSCR，

3、目前研究認為RET基因起關鍵作用。其他研究較多的還有GDNF，EDNR，NCX等。2、微環(huán)境因素阻止神經節(jié)細胞的正常發(fā)育。如胞外基質蛋白、神經生長因子及其受體的改變，影響了神經嵴細胞的存活和發(fā)育。3、某些局部因素。如缺血、缺氧、免疫因素、巨細胞病毒和寄生蟲感染等毀壞了腸壁內神經嵴細胞。 HSCR 術前診斷主要依據臨床癥狀結合對比灌腸造影(CE)、直腸肛管測壓(ARM)、直腸黏膜吸引活檢(RSB)、腸肌電圖等輔助檢查。CE診斷準確

4、率約45.245～80％。新生兒期鋇劑灌腸結腸造影時，痙攣段、移行段及擴張段分界不清，X線表現不典型。鋇劑灌腸時由于清潔腸道、肛管內注入氣泡等而出現“假性巨結腸”表現；鋇劑過稀出現水中毒，嚴重時危及患兒生命；若檢查前合并小腸結腸炎患兒易致腸穿孔造成鋇劑性腹膜炎。ARM對HSCR診斷準確率約為64.3％～71.43％。直腸黏膜吸引活檢(RSB)吸引的壓力不易掌握，壓力過低吸取不到黏膜或者黏膜厚度不夠，壓力過高有直腸穿孔的危險。腸肌電圖檢查

5、雖操作簡單，無痛苦，可反復檢查，但肌電圖的生理差異較大，各種波形判斷存在一定技術誤差，且受腸內糞便、小兒哭鬧和外括約肌肌電波形的影響，因而準確率較低。目前，先天性巨結腸癥的研究主要集中在病因學尤其是基因遺傳學方面，對于先天性巨結腸癥的診斷方法的研究國內外尚未見有新報道。而目前的診斷方法尚無法滿足臨床無創(chuàng)，簡便，高效，快速的早期診斷要求，因此，探討一種特異性強、靈敏性高、無創(chuàng)的診斷方法成為必需。 SELDI-TOF-MS技術是20

6、02年開發(fā)的新型蛋白質組學技術，應用基因芯片的設計原理，把層析、質譜等技術合理地與蛋白質芯片結合，可檢測出傳統方法很難鑒定的蛋白質和多肽，具有快速、靈敏、高通量等特點，在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌等的標記物篩選和早期診斷研究方面已經取得重大突破。 研究目的 檢測先天性巨結腸癥患兒血清蛋白質，篩選特異的蛋白質標記物，構建用于先天性巨結腸癥早期篩選及診斷的血清蛋白質指紋圖譜模型。 材料與方法

7、 1．材料 1.1 標本 78例血清標本：先天性巨結腸癥42例，其他類型腸梗阻16例(闌尾炎術后腸梗阻8例、美克爾憩室術后腸梗阻3例、炎癥性腸梗阻5例)，正常對照組20例。所有先天性巨結腸癥標本均經病理學結果證實。先天性巨結腸癥中男33例，女9例，年齡3d-18a。正常對照組與先天性巨結腸癥組年齡、性別相匹配。 1.2 設備表面增強激光解析電離-飛行時間質譜(Surface Enhanced Laser Desorpt

8、ion/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)，PBS Ⅱ<'+>Ciphergen Inc．美國)。主要參數：收集范圍為1000-50000；優(yōu)化范圍為2000-30000． 1.3 芯片弱陽離子交換(WCX2)蛋白質芯片。 1.4 應用軟件和標記物評價指標應用軟件：Proteinchip Software 3.1，Biomarker Wiza

9、rd和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包。 支持向量機(SVM)：MATLAB6.50SU-SVM工具箱。 評價實驗的指標：靈敏性、特異性、Youden指數。 2．方法 2.1 血清樣本處理： U9 溶液處理冰浴中解凍的血清標本，100Mm NaNC (PH=4) 稀釋后，和Bioprocessor預處理過的WCX2蛋白芯片結合反應60分鐘，上述NaNC

10、緩沖液清洗芯片，取出芯片風干后點50％飽和的SPA溶液，上機讀片。 2.2 SELDI操作： SELDI質譜儀完成設置后，記錄每一例樣本的血清蛋白質質譜圖。原始數據先用Proteinchip Software 3.1做校正，使總離子的強度及分子量均一化。用Biomarker Wizard和ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包過濾噪音局部極值的方法找出樣本各自的峰，并過濾信噪比小于

11、2的峰，以10％為最小閾值做聚類分析，得到初步篩選結果。 2.3 血清樣本分組： ☆組1：先天性巨結腸癥組與正常對照組的比較☆組2：其他類型腸梗阻組與正常對照組的比較2.4 建模方法： 對初步篩選出來的質荷比峰做Wilconxon秩和檢驗，篩選每組有統計學意義的m/z值。 將有顯著差異的m/z值數據輸入支持向量機進一步分析，用訓練集建立判別模型，用測試集檢驗模型的效力，篩選用于建模的m/z值。 評

12、價模型的敏感性、特異性。 結果 1.先天性巨結腸癥組與正常對照組42例先天性巨結腸癥和20例正常對照血清標本檢測的質譜數據經過初步過濾篩選得到213個M/z峰，對其相對強度做wilconxon秩和檢驗分析得到P值小于0.01的M/Z峰13個，從差異顯著蛋白質峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的youden指數最高的組合模型，篩出M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的標志物3個，在先天性巨結腸癥組低表達，

13、在正常對照組高表達。聯合三個潛在標記物作為輸入值，留一法交叉檢測，在測試集上判別模型的特異性為100％，敏感度為100％。 2.其他類型腸梗阻組于正常對照組16例其他類型腸梗阻組(闌尾炎術后腸梗阻8例、美克爾憩室術后腸梗阻3例、炎癥性腸梗阻5例)和20例正常對照組血清標本檢測的質譜數據經過對比發(fā)現，在M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的3個血清蛋白質標志物處，兩組檢測結果無顯著性差異。 結論 SE