1、目的： 高同型半胱氨酸(tHcy)血癥作為動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因子得到了廣泛的重視。研究同型半胱氨酸(Hcy)代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的基因多態(tài)性是否影響血漿半胱氨酸濃度進(jìn)而是否與心腦血管病相關(guān)成為必要。本研究檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗塞(atheroscleroticcerebralinfarction，ACI)患者與正常對(duì)照者的血漿半胱氨酸濃度及MTRRA66G基因多態(tài)性，探討蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G基因多態(tài)性對(duì)血漿半胱

2、氨酸濃度的影響，并研究其在中國(guó)華東地區(qū)漢族人群中的分布及其與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗塞的關(guān)系。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)分組： 本實(shí)驗(yàn)選取2004年9月-2005年6月間本院神經(jīng)內(nèi)科動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗塞(atheroscleroticcerebralinfarction，ACI)患者94例，定為： (A)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗塞(ACI)組94例(男46例，女48例)，年齡43-80歲(59.0±10.5)歲。均符合全國(guó)第

3、四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭部CT及(或)MRI證實(shí)。不包括心律失常、動(dòng)脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的ACI；排除梗死后出血，肝、腎功能障礙的病例，以及自身免疫性疾病、妊娠、半年內(nèi)曾降脂治療者。 (B)正常對(duì)照組，選取2004年-2005年本院查體中心健康查體者145例(男75例，女70例)，年齡40-77歲(57.3±10.9)歲。均經(jīng)臨床檢查和(或)影像學(xué)檢查排除心、腦血管病，無(wú)腦血

4、管病家族史，排除肝、腎疾病、血液病、自身免疫性疾病、妊娠、半年內(nèi)曾有降脂治療者。兩組之間性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)無(wú)顯著性差異。所有入選者均為華東地區(qū)漢族，相互間無(wú)血緣關(guān)系。 2、血清生化指標(biāo)、血漿半胱氨酸濃度測(cè)定： 所有受試者取清晨空腹外周靜脈血5ml： 2ml靜止30分鐘后離心取血清，應(yīng)用OlympusU640自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清膽固醇TCH、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL及血糖

5、TG； 3ml與1.5mg/mlEDTAK2按100∶1體積抗凝，立即2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取20ul血漿用于測(cè)定血漿中半胱氨酸濃度，剩余血樣置4℃冰箱中儲(chǔ)存，一周內(nèi)成批提取DNA。 所有觀(guān)察對(duì)象均于采血當(dāng)日收集病史。 3、MTRR基因A66G多態(tài)性檢測(cè)： 取20ul血漿后的血樣置4℃冰箱中儲(chǔ)存，一周內(nèi)成批提取DNA(應(yīng)用美國(guó)Promega公司出品的DNA純化試劑盒)，DNA提取液置-20℃冰箱中儲(chǔ)存

6、。 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)檢測(cè)樣本MTRR基因。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)為： Primer1∶5'-CAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGACAT-3' Primer2∶5'-CACTTCCCAACCAACCAAAATTCTTCAAAG-3' 配制25μl反應(yīng)體系，基因組DNA200ng、引物20pmol、MgCl21.5mmol/L、dNTP200μol/

7、L、tag酶1U。 94℃預(yù)變性5min，95℃變性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。最后1次循環(huán)后72℃延伸7min。 然后用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，-20℃保存。 將擴(kuò)增產(chǎn)物提純后，取22μl擴(kuò)增產(chǎn)物，10×buffer3μl，H2O1.5μl，限制性?xún)?nèi)切酶(NadeI)10U，37℃水浴消化過(guò)夜，以5.5％瓊脂糖電泳分析酶切產(chǎn)物，溴化乙錠染色，UVA凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)、攝片。

8、 由兩人分別判讀基因型，對(duì)于不確定者選出重做。判讀方法如結(jié)果所示，比較兩組基因型和等位基因頻率分布有無(wú)差異。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 全部數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后，正態(tài)分布量以(x)±s表示，非正態(tài)分布變量以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換近似正態(tài)分布。遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)用Hardy-Weinberg平衡法。數(shù)值型變量采用單因素方差分析，分類(lèi)變量采用X2非參數(shù)檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用單因素Logistic回

9、歸。 結(jié)果： 1、血漿半胱氨酸水平： 血漿半胱氨酸水平在A(yíng)CI組(18.9±12.7μmol/L)顯著高于正常對(duì)照組(7.3±3.3μmol/L)，p＜0.001。 2、MTRRA66G基因型 MTRR基因第66位單個(gè)堿基腺嘌呤(A)突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤(G)，表現(xiàn)為AA、AG、GG三種基因型。研究證實(shí)野生純合子(基因型AA)存在NadeI酶切位點(diǎn)，酶切后電泳有124、27、151bp，無(wú)酶切位點(diǎn)酶切后電

10、泳只有151bp片斷。 即AA：124、27bp，AG：124、151、27bp，GG：151bp。 3、基因型分布比較 MTRR基因A66G多態(tài)性在研究人群中的分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(ACI組Df=1，x2=1.22，p＞0.05；對(duì)照組Df=1，x2=0.61，p＞0.05)，說(shuō)明本研究組人群具有群體代表性，不存在選擇偏倚。AA、AG、GG基因型頻率在A(yíng)CI組為12.8％、53.2％和3

11、4％，對(duì)照組分別為26.2％、53.1％和20.7％。組間基因型頻率差異有顯著性(x2=8.84，p=0.01)。 4、基因多態(tài)性與血漿Hcy水平的比較組內(nèi)比較GG基因型血漿半胱氨酸濃度均高于其他兩種基因型。 5、ACI形成危險(xiǎn)因素分析： 以血漿Hcy濃度、MTRR基因型、TCH、Glu和HDL為自變量，ACI發(fā)生為因變量的Logistic多元回歸分析顯示，血漿Hcy濃度、TCH、Glu是危險(xiǎn)因素；相關(guān)分析顯示，

12、血漿Hcy濃度與TCH、Glu均無(wú)相關(guān)性，表明Hcy濃度升高是ACI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，OR=1.286。而MTRR基因型并非獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 結(jié)論： 1、同型半胱氨酸可通過(guò)刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，破壞機(jī)體凝血和纖溶平衡，使內(nèi)皮損傷和功能異常等，使機(jī)體處于血栓前狀態(tài)，從而增加了心腦血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)性。本實(shí)驗(yàn)中血漿半胱氨酸水平在A(yíng)CI組顯著高于正常對(duì)照組，證實(shí)高Hcy血癥與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗塞有關(guān)，是ACI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之

13、一。 2、MTRR催化無(wú)活性蛋氨酸合成酶轉(zhuǎn)換成有活性的酶，從而在蛋氨酸和葉酸循環(huán)中起重要作用。發(fā)生突變后蛋氨酸殘基被異亮氨酸替代，有可能影響酶的催化活性，導(dǎo)致半胱氨酸代謝受阻。本次結(jié)果中MTRRAA、AG基因型同型半胱氨酸水平與GG基因型同型半胱氨酸水平相比有明顯差異，說(shuō)明MTRR基因型不同會(huì)影響Hcy在血漿中的濃度。 3、MTRR多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率在不同種族中有差異性，本次研究首次揭示了華東地區(qū)漢族MTRR基因的等

14、位基因頻率(A等位基因47.45％、G等位基因52.45％)，兩組間等位基因頻率分布無(wú)顯著性(p＞0.05)。在本研究中MTRR基因A66G多態(tài)性在研究人群中的分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡，MTRRAA、AG、GG基因型頻率在A(yíng)CI組為12.8％、53.2％和34％，對(duì)照組分別為26.2％、53.1％和20.7％，AA、AG、GG基因型頻率在組間有差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。提示MTRR多態(tài)性可能與動(dòng)脈粥樣硬化