1、【背景】
　　心肌肥大是心肌受到多種體內(nèi)外應(yīng)激因素刺激(如:高血壓、瓣膜性心臟病、心肌梗死和心肌病等)時發(fā)生的一種代償性適應(yīng)性反應(yīng)。心肌肥大是心血管疾病發(fā)生的獨立致病危險因素,當(dāng)心肌過度肥大時容易導(dǎo)致心力衰竭或者其他心臟相關(guān)疾病如惡性心律失常和心源性猝死等的發(fā)生。因此,抗心肌肥大的藥物治療具有重要的臨床意義。目前已經(jīng)確定具有逆轉(zhuǎn)心肌肥大的藥物主要有α1阻斷劑哌唑嗪、Ca2+阻斷劑尼群地平、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利等。但這些藥

2、物由于療效或者安全性問題,有其臨床局限性。那么,尋找更加安全有效的靶向藥物,成為科學(xué)工作者亟待解決的關(guān)鍵問題。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是機體非溶酶體降解主要的蛋白降解通路。大量研究資料顯示,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的功能改變與心肌肥大之間關(guān)系密切,抑制蛋白酶體功能,可以通過干預(yù)Akt,calcineurin/NFAT,MAPK及TGF-β1(thetransforminggrowthfactorβ1)/Smad等多條與心肌肥大相關(guān)的信號

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,阻止心肌肥大的發(fā)生。這將為人們尋找逆轉(zhuǎn)心肌肥大藥物提供了明確的思路和線索。研究已證實,蛋白酶體抑制劑PS-519及MG132分別對異丙腎上腺素及主動脈結(jié)扎所致的左心肥大具有明顯的改善作用。但是目前這些藥物由于毒副作用高等原因,仍處于研究階段。
　　藤黃酸是中藥藤黃的主要成分,具有多種生物學(xué)活性如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗感染等,特別是其抗腫瘤作用研究較多,能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞如MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞、RP

4、MI-8226多發(fā)性骨髓瘤、人胃癌BGC-823及MKN-28細(xì)胞等的生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本課題組前期對藤黃酸的研究中發(fā)現(xiàn):蛋白酶體是藤黃酸的特異性作用靶點;藤黃酸是一種蛋白酶體抑制劑的前體藥物,在體可以通過CYP2E1代謝為具有活性的蛋白酶體抑制劑。既然藤黃酸是一種有效的蛋白酶體抑制劑,那么它能否具有逆轉(zhuǎn)心肌肥大的效應(yīng),目前尚不太清楚。
　　NF-κB是一種可廣泛誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,它可激活許多基因的表達(dá),包括與免疫、炎癥反應(yīng)

5、、細(xì)胞生存及凋亡、以及細(xì)胞周期等有關(guān)的基因。在NF-κB通路激活過程中,IκB蛋白發(fā)生磷酸化和降解是NF-κB激活、轉(zhuǎn)位入核及刺激基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟,而這個過程依賴于泛素蛋白酶體系統(tǒng)的激活,然后通過降解IKB從而使NF-κB由胞漿進(jìn)入細(xì)胞核,啟動轉(zhuǎn)錄。研究表明,NF-κB與心肌肥大相關(guān)的信號通路關(guān)系密切。并且NF-κB通路的激活是心肌肥大發(fā)展過程中必不可少的因素。因此,本課題在探討藤黃酸對心肌肥大影響的基礎(chǔ)上,又觀察藤黃酸對NF-κB通

6、路相關(guān)分子表達(dá)的影響,以揭示藤黃酸的作用機理。
　　根據(jù)前期研究結(jié)果,我們提出這樣的研究設(shè)想:藤黃酸可以通過抑制泛素蛋白酶體的功能,干預(yù)NF-κB通路的激活,從而阻止或延緩心肌肥大的發(fā)生。為此我們建立了三種心肌肥大動物模型,包括應(yīng)用異丙腎上腺素導(dǎo)致左心肥大、腹主動脈縮窄所致左心肥大以及長期慢性缺氧所致的右心肥大動物模型。在課題的第一部分,主要探討了藤黃酸對三種動物模型所致心肌肥大的影響。第二部分探討了藤黃酸的作用機制,主要是觀察藤

7、黃酸對NF-κB通路相關(guān)分子表達(dá)的影響,為藤黃酸在抑制心肌肥大中的應(yīng)用提供理論支持。
　　第一部分藤黃酸對不同因素所致心肌肥大的影響
　　目的:
　　探討藤黃酸對不同因素所致心肌肥大的影響,為藤黃酸非腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　本課題建立了三種動物模型,分別是:長期慢性缺氧(氧濃度控制在10％左右,持續(xù)21天)所致的右心肥大動物模型;腹主動脈縮窄(0.7mm,持續(xù)一周)所致左心肥大以及異

8、丙腎上腺素(30mg/kg/day,皮下注射,持續(xù)一周)導(dǎo)致的左心肥大。在缺氧所致心肌肥大模型中,分別應(yīng)用1mg/kg/dMG132和
　　0.75mg/kg/d藤黃酸進(jìn)行干預(yù)。在腹主動脈縮窄及異丙腎上腺素所致左心肥大模型,采用藤黃酸1.5mg/kg隔天給藥一次進(jìn)行干預(yù)。動物分組:缺氧模型分組為,常氧對照組(Normoxia+Vehicle);常氧+GA/MG132組(Normoxia+GA/MG132);缺氧對照組(Hypoxi

9、a+Vehicle);缺氧+GA/MG132組(Hypoxia+GA/MG132)。腹主動脈縮窄模型分組為假手術(shù)組(sham組),腹主動脈縮窄組(AAC組)及藥物治療組(AAC+GA組)。異丙腎上腺素模型分組為:對照組(control組),模型組(ISO組)及藥物治療組(ISO+GA組)。實驗結(jié)束時,分別稱量各組大鼠體重、心臟重量用以計算心臟系數(shù)(心臟重量/大鼠體重);HE染色觀察各組大鼠心臟病理形態(tài)學(xué)變化;Masson染色觀察各組大鼠

10、心臟膠原組織變化;RealtimePCR觀察藤黃酸對心肌組織病理性肥大基因α-SK-actin及BNP的影響。
　　結(jié)果:
　　1.在缺氧所致右心肥大模型中,與常氧對照組相比,缺氧對照組大鼠心臟指數(shù),有顯著升高(P<0.05);與缺氧對照組相比,缺氧+GA組心臟指數(shù)明顯減小(P<0.05),缺氧+MG132組心臟指數(shù)同樣明顯減小(P<0.01)。與常氧對照組相比,缺氧對照組右心指數(shù)有明顯升高(P<0.01),與缺氧對照組相比

11、,缺氧+GA組右心指數(shù)明顯減小(P<0.01),缺氧+MG132組右心指數(shù)同樣明顯減小(P<0.05)。腹主動脈縮窄所致左心肥大模型中,與sham組相比,AAC組心臟指數(shù)有明顯提高(P<0.05),與AAC組相比,AAC+GA組心臟指數(shù)出現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。在異丙腎上腺素所致左心肥大模型中,與control組相比,ISO組心臟指數(shù)有明顯提高(P<0.01);與ISO組相比,ISO+GA組心臟指數(shù)出現(xiàn)明顯降低(P<0.01)。

12、r>　　2.光鏡下觀察HE染色,結(jié)果顯示,常氧對照組及常氧+GA組心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色,胞漿呈粉紅色,心肌細(xì)胞排列正常,間質(zhì)無明顯增生等表現(xiàn);缺氧對照組可以看到心肌細(xì)胞明顯呈現(xiàn)明顯肥大,心肌纖維變粗,有些心肌纖維排列紊亂、甚至出現(xiàn)斷裂;缺氧+GA組較缺氧對照組肥大有所減輕,心肌纖維排列也較為整齊。這一結(jié)果通過Masson染色得到了進(jìn)一步的證明,特別是肥大后膠原組織的增生更加明顯,而應(yīng)用藤黃酸后得到明顯的改善。對于主動脈結(jié)扎以及異丙腎上腺素所

13、致心肌肥大的模型中,HE染色觀察,也可以看到對照組心肌組織心肌細(xì)胞排列正常,間質(zhì)無明顯增生等異常的表現(xiàn);模型組心肌細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度肥大,肌纖維變粗,排列紊亂等表現(xiàn);而應(yīng)用藤黃酸后這種異常的表現(xiàn)得到明顯的改善。Masson染色同樣可以看到肥大后膠原組織的增生明顯,而應(yīng)用藤黃酸后得到改善的情況。
　　3.缺氧所致右心肥大模型中,與常氧對照組以及常氧+GA組相比,缺氧后心肌組織α-SK-actin及BNPmRNA的相對表達(dá)量明顯升高,

14、應(yīng)用藤黃酸后這兩種病理表達(dá)基因的mRNA表達(dá)明顯下降。而對于主動脈結(jié)扎以及異丙腎上腺素所致心肌肥大的模型,同樣可以觀察到模型組出現(xiàn)α-SK-actin及BNPmRNA的相對表達(dá)量升高,應(yīng)用藤黃酸后這兩種病理表達(dá)基因的mRNA表達(dá)下降的情況。結(jié)論
　　藤黃酸對長期慢性缺氧、腹主動脈縮窄以及異丙腎上腺素所致的心肌肥大均具有改善作用。
　　第二部分藤黃酸逆轉(zhuǎn)心肌肥大的機制研究
　　目的:
　　1.觀察藤黃酸對肥大心肌組

15、織蛋白酶體chymotrypsin(CT)-like酶活性的影響;
　　2.探討藤黃酸對NF-κB通路相關(guān)信號分子表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.熒光酶標(biāo)儀測定各組肥大心肌組織純化20S蛋白酶體chymotrypsin(CT)-like酶活性;
　　2.Westernblot檢測各組肥大心肌組織IKBα、蛋白酶體β5亞單位、胞漿胞核P65、細(xì)胞因子(IL-2,MCP-1)表達(dá)變化;
　　3.EMSA檢測藤

16、黃酸對三種模型所致肥大心肌組織胞核NF-κB與DNA結(jié)合活性;
　　結(jié)果:
　　1.MG132及藤黃酸能夠使缺氧后肥大心肌組織純化20S蛋白酶體chymotrypsin(CT)-like酶活性出現(xiàn)明顯下降(P<0.05,P<0.01);同樣在主動脈結(jié)扎以及異丙腎上腺素致大鼠左心肥大的模型中,我們同樣看到了相似的結(jié)果,模型組蛋白酶體chymotrypsin(CT)-like酶活性出現(xiàn)升高(P<0.01),應(yīng)用藤黃酸后,該酶活性

17、出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)。
　　2.Westernblot檢測結(jié)果顯示,在缺氧致大鼠心肌肥大模型中,IKBα在缺氧+GA組表達(dá)明顯增強,而蛋白酶體β5亞單位的表達(dá)減弱。在主動脈結(jié)扎以及異丙腎上腺素致大鼠左心肥大的模型中,肥大心肌藤黃酸給藥組IKBα表達(dá)同樣出現(xiàn)了增強的趨勢,而蛋白酶體β5亞單位的表達(dá)減弱的趨勢。胞漿胞核P65表達(dá)結(jié)果顯示,藤黃酸作用后,三種模型所致肥大心肌組織胞核中P65表達(dá)均出現(xiàn)了不同程度的降低。炎癥介質(zhì)檢測

18、結(jié)果顯示,在缺氧致大鼠心肌肥大模型中,應(yīng)用藤黃酸后肥大心肌組織IL-2表達(dá)明顯下降,同樣在主動脈結(jié)扎以及異丙腎上腺素致大鼠左心肥大的模型中,肥大心肌藤黃酸給藥組IL-2,MCP-1表達(dá)均出現(xiàn)了下降。
　　3.EMSA檢測三種模型所致肥大心肌組織胞核NF-κB與DNA結(jié)合活性,結(jié)果顯示,應(yīng)用藤黃酸后,肥大心肌組織NF-κB與DNA結(jié)合活性明顯降低。
　　結(jié)論:
　　1.藤黃酸能夠降低三種模型肥大心肌組織chymotryp