1、目的:
　　通過對人前列腺癌細(xì)胞系PC-3、LNCaP、DU-145、22RV1的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探討前列腺癌細(xì)胞Slug的表達(dá)情況,以及Slug通過對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinD1的調(diào)控影響前列腺癌細(xì)胞的生長,及Slug對前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。從而認(rèn)為Slug可以做為一種新穎的治療手段以預(yù)防和延緩前列腺癌的的進(jìn)展。
　　材料和方法:
　　體外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系PC-3、LNCaP、DU-145、22RV1;構(gòu)建質(zhì)

2、粒pMIGW-CyclinD1-HA和質(zhì)粒pMIGW-CylinD1-HAT286A;SDS-PAGE及WesternBlot檢測Slug、CyclinD1、CyclinD2、HA、α-Tubulin、β-actin蛋白的表達(dá);利用表達(dá)Slug、CyclinD1-HA、CylinD1-HAT286A以及其空白對照的pMIG載體制備逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus),用表達(dá)Slug-shRNA以及其空白對照的pLK0.1載體制備慢病毒(l

3、entivirus),并用制備的病毒感染PC-3和DU-145細(xì)胞系;提取前列腺癌細(xì)胞的所有RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;RT-PCR和Real-TimePCR檢測Snai11、Snai12/Slug、Snai13、Scratch1、Scratch2、CyclinD1mRNA的表達(dá)。
　　流式細(xì)胞儀分別檢測經(jīng)過碘化丙錠(PI)染色的含有pMIGRI載體以及pMIGRI-Slug載體的兩種PC-3細(xì)胞系的DNA含量進(jìn)而分析其細(xì)胞周期的

4、變化;用MTT法分別檢測含有pMIGRI載體以及pMIGRI-Slug載體的兩種PC-3細(xì)胞系的體外生長情況,用快速細(xì)胞增殖法分別檢測含有pMIGRI載體、pMIGRI-Slug載體、pMIGW-CylcinD1-HA載體的兩三種PC-3細(xì)胞系以及含有pLK0.1載體和pLK0.1-shSlug載體的兩種DU-145細(xì)胞系的體外生長情況;把含有pMIGRI載體以及pMIGRI-Slug載體的兩種PC-3細(xì)胞系分別注入NCR-nu/nu裸

5、鼠的左右背部皮下構(gòu)建體內(nèi)腫瘤模型,從而檢測兩種細(xì)胞系在體內(nèi)的生長情況。
　　DU-145細(xì)胞系分別加入0μ1、10μ1、20μ1、40μl表達(dá)人Slug的腺病毒,4天后WesternBlot檢測Slug、CyclinD1蛋白表達(dá)變化,Real-TimePCR檢測Slug、CyclinD1mRNA表達(dá)變化。在含有pMIGW-CyclinD1-HA載體和pMIGW-CylinD1-HAT286A載體的兩種PC-3細(xì)胞系中分別加入0μ1

6、、40μ1、80μ1、120μ1表達(dá)人Slug的腺病毒,5天后WesternBlot檢測Slug、CyclinD1蛋白表達(dá)變化;在含有pMIGW-CyclinD1-HA載體和用0.1μM/LMG-132(泛素化信號通路抑制劑)處理的含有pMIGW-CylinD1-HA載體的PC-3細(xì)胞系中分別加入30μ1、60u1表達(dá)人Slug的腺病毒,3天后WesternBlot檢測CyclinD1蛋白表達(dá)變化;免疫共沉淀法檢測轉(zhuǎn)染了pMIGW-Sl

7、ug-HA載體的U20S細(xì)胞中Slug蛋白和CyclinD1蛋白的結(jié)合;免疫熒光雙重染色激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測同時轉(zhuǎn)染pcDNA-CyclinD1-HA載體和pMIGW-Slug-GFF,載體的U20S細(xì)胞系中Slug蛋白和CyclinD1蛋白的結(jié)合情況。
　　劃痕試驗(yàn)和基底膜基質(zhì)試驗(yàn)檢測含有pMIGRI載體以及pMIGRI-Slug載體的兩種PC-3細(xì)胞系的體外侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　與野生型小鼠的前列腺組

8、織蛋白樣品相比,轉(zhuǎn)基因小鼠前列腺癌(TRAMP)模型的前列腺癌組織蛋白樣品Slug蛋白表達(dá)量升高。Slug蛋白在PC-3、LNCaP、22RV1三種人前列腺癌細(xì)胞系中呈高表達(dá),其中在LNCaP中的表達(dá)量最高,PC-3、22RV1次之。而在DU-145中的表達(dá)量最低。在Snai11、Snai12/Slug、Snai13、Scratch1、Scratch2五個Slug/Snail超級家族成員中,只有Slug在四種前列腺癌細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄水平較

9、為明顯,且各細(xì)胞之間的表達(dá)量存在明顯的差異(P＜0.05),其中在PC-3細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄水平最高、DU-145、LNCaP次之,在22RV1細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄水平最低。Slug在四種前列腺癌細(xì)胞系中的蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平無相關(guān)性。Slug的表達(dá)量與p53的表達(dá)量不存在負(fù)相關(guān)性。
　　與含有pMIGRI載體的PC-3和DU-145細(xì)胞系相比,含有pMIGRI-Slug載體的PC-3和DU-145細(xì)胞系生長速度變慢,兩者生長曲線存在統(tǒng)計學(xué)的

10、差異(P＜0.05)。與含有pMIGRI載體的PC-3細(xì)胞系相比,含有pMIGRI-Slug載體的PC-3細(xì)胞系G0/G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少,兩者各時期細(xì)胞數(shù)目之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。與含有pLK0.1載體的PC-3細(xì)胞系相比,含有pLKO.1-shSlug載體的PC-3細(xì)胞系生長速度變快,兩者生長曲線存在統(tǒng)計學(xué)的差異(P＜0.05)。
　　與含有pMIGRI載體的PC-3細(xì)胞系相比,含有pMIGRI-Slug載

11、體的PC-3細(xì)胞系的CyclinD1蛋白表達(dá)量下調(diào)。與含有pLK0.1載體的PC-3細(xì)胞系相比,含有pLK0.1-shSlug載體的PC-3細(xì)胞系的CyclinD1蛋白表達(dá)量上調(diào)。與陰性對照組相比,加入10μ1、20μ1,、40μ1表達(dá)人Slug的腺病毒4天后均可引起含有pMIGRI-Slug載體的DU-145細(xì)胞系的CyclinD1蛋白表達(dá)量下調(diào),且呈劑量依賴關(guān)系;但其mRNA的表達(dá)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與陰性對照組相比

12、,加入40μ1、80μ1、120μ1表達(dá)人Slug的腺病毒5天后均可引起含有pMIGW-cyclinD1-HA載體的PC-3細(xì)胞系的HA-CyclinD1蛋白表達(dá)量下調(diào),且呈劑量依賴關(guān)系,但含有pMIGW-CylinD1-HAT286A載體的PC-3細(xì)胞系的HA-CyclinD1蛋白表達(dá)量沒有明顯變化。與陰性對照組相比,加入30μ1、60μ1表達(dá)人Slug的腺病毒3天后均可引起含有pMIGW-CyclinD1-HA載體的PC-3細(xì)胞系的

13、HA-CyclinD1蛋白表達(dá)量下調(diào),且呈劑量依賴關(guān)系,但用0.1μM/LMG-132(泛素化信號通路抑制劑)處理的表達(dá)pMIGw-CylinD1-HA載體的PC-3細(xì)胞系的HA-CyclinD1蛋白表達(dá)量沒有明顯變化。免疫共沉淀法顯示HA-Slug蛋白和CyclinD1蛋白被同時沉淀下來。免疫熒光雙重染色激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)顯示在U20S細(xì)胞中與Slug相結(jié)合的綠色熒光蛋白(GFP)和與HA-CyclinD1相結(jié)合的紅色熒光蛋白(

14、RFP)部分重疊。與含有pMIGRI-Slug載體的PC-3細(xì)胞系相比,同時含有pMIGRI-Slug和pMIGW-CylinD1-HA載體的PC-3細(xì)胞系生長速度增快,兩者生長曲線存在統(tǒng)計學(xué)的差異(P＜0.05),但與含有pMIGRI載體的PC-3細(xì)胞系的生長曲線無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　劃痕試驗(yàn)顯示與陰性對照組相比含有pMIGRI-Slug載體的PC-3細(xì)胞系具有較強(qiáng)的細(xì)胞移動速度,而含有pLKO.1-shSlug載

15、體的PC-3細(xì)胞系細(xì)胞移動速度較慢?；啄せ|(zhì)試驗(yàn)顯示與陰性對照組相比含有pMIGRI-Slug載體的PC-3細(xì)胞系具有較多的侵襲細(xì)胞數(shù),兩組存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Slug蛋白高表達(dá)于鼠的前列腺癌組織中。在PC-3、LNCaP、DU-145、22RV1四種前列腺癌細(xì)胞系中,Slug蛋白是呈選擇性高表達(dá)的,且其表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾水平調(diào)節(jié)。Slug的表達(dá)是不受腫瘤抑制基因p53調(diào)控的。

16、Slug表達(dá)上調(diào)可以使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinD1降解,從而使細(xì)胞周期G0/G1期延長,S期縮短,進(jìn)而在體內(nèi)和體外抑制前列腺癌細(xì)胞的生長。Slug表達(dá)上調(diào)引起CyclinD1蛋白降解主要不是通過Slug蛋白抑制CyclinD1基因的轉(zhuǎn)錄,而是通過Slug蛋白和CyclinD1蛋白相互結(jié)合在泛素化依賴信號通路的作用下完成的。Slug高表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞在體外的侵襲和轉(zhuǎn)移。因而對Slug表達(dá)信號通路的調(diào)節(jié)可以作為前列腺癌重要的治療