1、白念珠菌是最常見的條件性致病菌,由白念珠菌引起的感染逐年上升,引起人們廣泛的關(guān)注。白念珠菌細胞形態(tài)從酵母型向菌絲型的轉(zhuǎn)換與其感染能力和毒力密切相關(guān)。細胞對外界pH的應(yīng)答是由保守的信號傳導(dǎo)途徑RIM101途徑所控制,白念珠菌中許多依賴pH表達的基因受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白的調(diào)控。pH條件影響著鐵離子的生物可利用率,由此推測鐵吸收系統(tǒng)受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白調(diào)控。鐵離子的吸收是白念珠菌在宿主中定居、存活和致病過程中重要的影響因素。鐵吸收

2、系統(tǒng)的調(diào)控對白念珠菌生存起非常重要的作用,其中高鐵還原酶是高親和性吸收系統(tǒng)的第一個關(guān)鍵酶,高鐵還原酶基因表達的開啟與關(guān)閉將直接影響白念珠菌吸收鐵離子的能力。白念珠菌基因中含有17個編碼高鐵還原酶的基因,因此研究這些基因的表達調(diào)控,通過構(gòu)建基因缺失突變株分析基因的功能,發(fā)現(xiàn)與形態(tài)轉(zhuǎn)換相關(guān)的新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等有助于更加深入的了解白念珠菌是如何在宿主中(低鐵環(huán)境)存活的,而且本研究所鑒定與識別的靶點將為白念珠菌的感染治療和藥物開發(fā)提供重要的理

3、論依據(jù)。
　　 首先,通過Northern雜交的方法檢測高鐵還原酶基因FRE1,FRE2,FRE10,FRE11,FRP1和FRP2在酸性(pH4)和堿性(pH8)培養(yǎng)條件下,以及在酸性和堿性的培養(yǎng)基中分別添加50μmol/L BPS,1.50μmol/L BIP和150μmol/L菲洛嗪(Fetrozine)鐵離子螯合劑所造成低鐵環(huán)境中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FRE10為酸性pH應(yīng)答基因；FRE1、FRE2、FRE11和FRP2為

4、堿性應(yīng)答基因；FRP1的表達較為特殊:既是堿性應(yīng)答基因,又是低鐵條件應(yīng)答基因。
　　 然后,利用PCR介導(dǎo)的同源重組的方法構(gòu)建了白念珠菌高鐵還原酶fre1△/△、fre2△/△、fre5△/△、fre10△/△和frp1△/△單基因缺失突變株以及fre1△/△fre2△/△、fre2△/△fre10△/△兩株雙基因突變株,并對上述基因缺失突變株和實驗室保存的缺失突變株的細胞高鐵還原酶活性進行分析,結(jié)果表明在酸性條件下(pH4),

5、fre10△/△以及含有fre10突變的fre2△/△fre10△/△和fre5△/△fre10△/△雙基因突變株都導(dǎo)致高鐵還原酶活性大大降低,說明Fre10p是酸性條件下高鐵還原酶活性的主要貢獻者；堿性條件下(pH8),fre2△/△以及含有fre2突變的fre2△/△fre10△/△和fre1△/△fre2△/△雙基因突變株都導(dǎo)致高鐵還原酶活性大大降低,說明Fre2p是堿性條件下高鐵還原酶活性的主要貢獻者；而其它基因例如fre1、f

6、re5、fre8、fre9、fre71、frp1和frp2基因的缺失突變不影響菌株在pH4、pH4+50μmol/L BPS和pH8培養(yǎng)條件下高鐵還原酶的活性。
　　 通過對已獲得的高鐵還原酶基因缺失突變株在低鐵條件下生長情況的比較發(fā)現(xiàn):在YPG培養(yǎng)基中所有菌株都生長良好,而在YPG+150μmol/L,BPS的低鐵培養(yǎng)基中,只有fre2△/△突變株不能生長,在YPG+200μmol/L BPS的低鐵培養(yǎng)基中,fre2△/△和f

7、rp1△/△突變株都不能生長,這說明在較低濃度的鐵環(huán)境下Fre2p是吸收鐵離子的主要高鐵還原酶,但是在更低濃度的鐵離子環(huán)境中,Fre2p和Frp1p對菌株的生長同等重要,二者缺少任何一個都將導(dǎo)致菌株對低鐵環(huán)境敏感。
　　 構(gòu)建高鐵還原酶FRP1基因啟動子與lacZ基因的融合結(jié)構(gòu)(PFRP1-lacZ),并將PFRP1-lacZ分別轉(zhuǎn)入野生型和rim101△/△菌株中,結(jié)果表明Rim101p轉(zhuǎn)錄因子的缺失嚴重降低了FRP1基因啟動

8、子的活性。在野生型菌株中,酸性條件只能較低程度上誘導(dǎo)FRP1基因啟動子的活性；堿性條件可以明顯促進FRP1基因啟動子的活性,而且這種促進作用依賴于低鐵環(huán)境。
　　 通過對已經(jīng)克隆得到的982bp的FRP1基因啟動子序列進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在兩個可能的Rim101p結(jié)合序列,分別位于-629位點和-157位點。通過電泳遷移率實驗確定Rim101p能夠與FRP1啟動子內(nèi)部的兩個結(jié)合位點直接結(jié)合,再通過定點突變的方法,構(gòu)建含有Rim1

9、01p結(jié)合序列突變的FRP1基因啟動子P-157mut、P-629mut和P-157,-629mut,并檢測含有突變啟動子菌株的β-半乳糖苷酶的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn):-157位點的突變并沒有改變啟動子的活性,與含有P-lacZ結(jié)構(gòu)的菌株的活性相似；但是-629位點的突變造成菌株的lacZ活性比野生型降低了6倍,這表明-629位點在Rim101p調(diào)控FRP1表達的過程中起著非常重要的作用,而-157位點對于基因的表達調(diào)控并不重要。
　　

10、 利用同源重組的方法,構(gòu)建含有FRP1:GFP融合結(jié)構(gòu)的菌株,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光分布于細胞質(zhì)內(nèi),并且可以清楚地發(fā)現(xiàn)Frp1蛋白定位于細胞的液泡中,通過軟件分析表明Frp1p是一個具有5次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白,因此可以得知白念珠菌Frp1p定位于液泡膜。
　　 在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)了白念珠菌Aft類型的轉(zhuǎn)錄因子Aft2p,并將AFT2基因在釀酒酵母中進行表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaAFT2基因在釀酒酵母PGK1強啟動子的誘導(dǎo)下能夠彌補

11、Scaft1△菌株的生長缺陷,這說明白念珠菌Aft2p轉(zhuǎn)錄因子與釀酒酵母Aft類型的轉(zhuǎn)錄因子具有功能相似性。同時構(gòu)建白念珠菌aft2△/△缺失突變株和AFT2基因的回補突變株并進行表型分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)棚的缺失不影響菌株在液體和固體培養(yǎng)基中的生長,但是基因突變改變了菌落的形態(tài),缺失突變株在固體培養(yǎng)基中不能形成菌絲,同時aft2的缺失對細胞高鐵還原酶活性產(chǎn)生較大影響,而且以小鼠為模型的系統(tǒng)感染實驗表明白念珠菌aft2基因的缺失在較大程度上減弱