1、惡性腫瘤是目前危害人體生命和健康的嚴(yán)重疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界癌癥每年發(fā)病約1000萬人，死亡約700萬人，已成為人類僅次于心血管病的第二殺手。因此探索有效的腫瘤治療方法成為必然。
　　 在惡性腫瘤的治療中，藥物治療占有重要地位。在合成的化學(xué)類抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)是以天然抗腫瘤活性成分為先導(dǎo)的化合物。因而，從天然植物成分中，篩選能夠引起細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，將是今后抗腫瘤治療最理想的途徑。<

2、br>　　 沙灘馬鞭草是原產(chǎn)于巴拉圭的多年生藥用植物。目前有關(guān)沙灘馬鞭草藥理活性的研究主要集中在對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的增強(qiáng)作用方面，還未見沙灘馬鞭草及其提取物有抗腫瘤活性的報(bào)道。
　　 本研究對(duì)從沙灘馬鞭草中提取的16個(gè)單一成分的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步篩查，并對(duì)其中抗腫瘤活性較強(qiáng)的16＃成分的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　 宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。為此，我

3、們選擇了HeLa細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）為研究對(duì)象，觀察沙灘馬鞭草提取物對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，并從細(xì)胞凋亡方面來進(jìn)一步探討沙灘馬鞭草提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理。
　　 材料與方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)：
　　 將HeLa細(xì)胞接種于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中，2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 二、沙灘馬鞭草提取物的制備
　　 單體化合物編號(hào)

4、1-16，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)提供，從沙灘馬鞭草Verbena，littoralisH.B.K.的甲醇提取物中利用硅膠吸附柱色譜、SephadexLH-20柱色譜和半制備型HPLC等方法分離得到，通過理化常數(shù)和光譜數(shù)據(jù)分析（EI-MS、1HNMR、13CNMR、HMQC和HMBC）鑒定其結(jié)構(gòu)。每個(gè)單體化合物經(jīng)DMSO溶解制成儲(chǔ)備液，4℃避光保存。
　　 三、MTT法檢測(cè)沙灘馬鞭草提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　 1、沙灘馬

5、鞭草16種提取物抗腫瘤活性的篩查
　　 采用MTT的方法，選用大腸癌細(xì)胞系CloneA對(duì)沙灘馬鞭草16種提取物的生物學(xué)活性進(jìn)行篩查。
　　 2、16?；衔飳?duì)不同腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用
　　 采用MTT的方法，用篩選到的有生物學(xué)活性的化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行作用，觀察其對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是否存在選擇性。
　　 四、16?；衔飳?duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用
　　 1、16?；?/p>

6、合物對(duì)HeLa細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用
　　 我們以生長(zhǎng)抑制作用最為明顯的HeLa細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用不同濃度的16＃化合物作用HeLa細(xì)胞24h后，觀察其生長(zhǎng)抑制作用。
　　 2、16?；衔飳?duì)HeLa細(xì)胞作用后的細(xì)胞形態(tài)變化觀察
　　 不同濃度的16＃化合物作用HeLa細(xì)胞24h，相差顯微鏡下對(duì)形態(tài)進(jìn)行觀察；不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細(xì)胞24h，熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)

7、檢測(cè)16＃化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
　　 不同濃度的16＃化合物作用HeLa細(xì)胞24h，采用Annexin-v/PI凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行凋亡率的測(cè)定。
　　 4、凝膠電泳檢測(cè)16?；衔飳?duì)HeLa細(xì)胞作用的DNA片段化
　　 分別用10、20μmol的16?；衔镒饔肏eLa細(xì)胞24h，收集細(xì)胞、提取全基因組DNA，經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其基因組DNA變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一

8、、沙灘馬鞭草提取物的篩選與生物活性的鑒定
　　 1、沙灘馬鞭草16種提取物抗腫瘤活性的篩查
　　 沙灘馬鞭草16種提取物中的第16＃化合物對(duì)CloneA細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最為顯著，說明16?；衔锸强鼓[瘤作用的有效成分。
　　 2、16＃化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用
　　 采用MTT的方法，用篩選到的有生物學(xué)活性的16?；衔飳?duì)不同腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行作用，發(fā)現(xiàn)16＃化合物對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞均具有生長(zhǎng)抑制

9、作用。
　　 二、16?；衔飳?duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用
　　 1、16＃化合物對(duì)HeLa細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用
　　 16＃化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。且隨藥物濃度的增加，HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也逐漸增高。
　　 2、16＃化合物作用宮頸癌HeLa細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化
　　 不同濃度的16＃化合物作用HeLa細(xì)胞24h后，相差顯微鏡下對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀察可見：細(xì)胞變圓、體

10、積變小、細(xì)胞間隔稍增大，并可見凋亡小體。
　　 不同濃度的16?；衔镒饔肏eLa細(xì)胞24h后，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察可見明顯的凋亡小體。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)16?；衔飳?duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用
　　 采用Annexin-PI雙染標(biāo)定后。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見，16＃化合物可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，并且具有濃度依賴性。
　　 4、凝膠電泳檢測(cè)16?；衔飳?duì)HeLa細(xì)胞作用的DNA片段化