1、目的：探索從兔外周血中分離培養(yǎng)鑒定兩種內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs和EOCs)的方法.并將相同數(shù)量的EPCs和EOCs移植兔右頸總動(dòng)脈內(nèi)膜球囊損傷模型,觀察比較兩者在修復(fù)內(nèi)膜球囊損傷血管中發(fā)揮的作用. 方法：雄性新兩蘭大白兔隨機(jī)分為EPCs移植組(n=9)、EOCs移植組(n=9)和對(duì)照組(n=9).采用密度梯度離心法分離兔外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNCs).EPCs的分離和培養(yǎng):將所得MNCs接種到事先包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶(25cm<'

2、2>)罩,加入5ml含10﹪胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液.培養(yǎng)4天后,PBS液洗去未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),每3天換全液,培養(yǎng)第7天的細(xì)胞用于移植.EOCs的分離和培養(yǎng):將所得MNCs接種到事先包被纖維連接蛋白的6孔板的1孔中,加入3ml上述培養(yǎng)液.24小時(shí)后,以PBS洗去未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),前7天每天換半液,7天后每3天換全液.第二次傳代的細(xì)胞用于移植.采用標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-ac-LDL)攝取試驗(yàn)和荊豆凝集

3、素(FITC-LEA-1)結(jié)合實(shí)驗(yàn),以及CD34、flk-1和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色,體外血管形成試驗(yàn)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定. 采用內(nèi)膜球囊損傷術(shù),建立兔右頸總動(dòng)脈內(nèi)膜球囊損傷模型,通過常規(guī)組織病理切片HE染色、伊文思藍(lán)染色和掃描電鏡檢查評(píng)價(jià)內(nèi)膜損傷效果.并將細(xì)胞數(shù)為5×10<'5>的EPCs/EOCs重懸于100μl生理鹽水中移植至兔內(nèi)膜球囊損傷血管局部,對(duì)照組僅注入100μl生理鹽水.同時(shí)用CM-DiI標(biāo)記兩種細(xì)胞移植,進(jìn)行

4、細(xì)胞示蹤.術(shù)后4周,熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的兩種細(xì)胞在損傷血管段中的分布.采用伊文思藍(lán)染色,分析再生內(nèi)皮覆蓋率(RA/TA).通過常規(guī)組織病理切片HE染色計(jì)算新生內(nèi)膜面積(內(nèi)彈力板以內(nèi))與血管中膜面積(內(nèi)外彈力板之間)的比值(IA/MA). 結(jié)果：EPCs:培養(yǎng)5～6天后,貼壁的細(xì)胞匯聚形成大小不等的細(xì)胞簇.第7天的細(xì)胞形態(tài)不一,由梭彤細(xì)胞、嘲形細(xì)胞和不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞組成.細(xì)胞在1個(gè)月左右凋亡殆盡.EOCs:培養(yǎng)7～9天后,EOCs

5、開始出現(xiàn),并在培養(yǎng)的第9～12天迅速長(zhǎng)成集落.培養(yǎng)的第14～18天,細(xì)胞生長(zhǎng)至70﹪～80﹪匯合,細(xì)胞呈鋪路石樣排列,有很強(qiáng)的克隆增殖能力.通過激光掃描共聚焦顯微鏡鑒定,培養(yǎng)第7天的EPCs絕大部分能攝取ac-LDL并結(jié)合IJEA-1,雙陽(yáng)性率在90﹪以上;培養(yǎng)第16天的EOCs全部為雙陽(yáng)性細(xì)胞.免疫組化染色顯示,培養(yǎng)第7天的EPCs的CD34、flk-1和Ⅷ因子表達(dá)的免疫組化染色陽(yáng)性率分別為(85.92±2.36)﹪,(90.11±1

6、.96)﹪和(93.46±2.12)﹪;培養(yǎng)第16天的EOCs一致表達(dá)上述抗原,陽(yáng)性率均為100﹪.培養(yǎng)第7天的EPCs接種在matrigel凝膠上,僅見部分細(xì)胞伸長(zhǎng),未能形成血管腔樣的結(jié)構(gòu);將培養(yǎng)第16天的EOCs接種在matrigel凝膠上,置37℃培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)即能形成穩(wěn)定的血管腔樣的結(jié)構(gòu). 內(nèi)膜球囊損傷術(shù)后,通過常規(guī)組織病理切片HE染色、伊文思藍(lán)染色和掃描電鏡檢查證實(shí)血管內(nèi)膜面內(nèi)皮細(xì)胞基本去除,對(duì)內(nèi)彈力板、血管中膜及

7、外膜結(jié)構(gòu)無明顯影響. 術(shù)后4周,處死動(dòng)物,熒光顯微鏡下可見熒光標(biāo)記的兩類細(xì)胞在血管中膜、新生內(nèi)膜層和內(nèi)膜表面均有分布,并多數(shù)集中于血管中膜層與新生內(nèi)膜層交界附近.在標(biāo)記細(xì)胞的分布上,兩細(xì)胞移植組較相似.伊文思藍(lán)染色顯示,EPCs/EOCs移植組的再生內(nèi)皮覆蓋率均顯著高于對(duì)照組((91.6±3.6)﹪or(89.1±6.3)﹪vs(62.1±7.5)﹪,P<0.01),兩細(xì)胞移植組之間比較無顯著差異(P=0.50);同時(shí),常規(guī)組織

8、病理切片HE染色顯示,EPCs/EOCs移植組的新生內(nèi)膜增生程度均明顯低于對(duì)照組(0.48±0.11 or 0.44±0.06 vs 0.88±0.14,P<0.01),兩細(xì)胞移植組之間比較無顯著差異(P=0.59). 結(jié)論： 用不同的分離培養(yǎng)方法可在體外成功培養(yǎng)獲得兔外周血EPCs/EOCs. 綜合細(xì)胞形態(tài)觀察、熒光細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組化染色、及體外血管形成能力檢測(cè)可證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs/EOCs.