1、研究背景慢性錳中毒主要病理進程是選擇性的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)細胞的退行性變性，導致紋狀體多巴胺(DA)的耗竭，引起錐體外系功能失調(diào)。體內(nèi)和體外實驗揭示錳可能是一種多巴胺能神經(jīng)毒素，其產(chǎn)生的功能性損傷與自發(fā)性帕金森病(PD)錐體外系的表征和癥狀緊密相關。 α-共核蛋白(α-SYN)由140個氨基酸組成，為1988年Maroteaux等在用純化的抗突觸囊泡的抗血清從電鰻體內(nèi)表達篩選cDNA文庫時得到的一種新蛋白質(zhì)，為人類阿爾茨海

2、默病(AD)淀粉樣斑塊中非Aβ蛋白的前體蛋白，脊椎動物的α-SYN高度保守。自從發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病病理過程相關聯(lián)，越來越多的實驗試圖揭示α-SYN的生理功能及其與其他蛋白之間的相互關系。目前，關于這種蛋白的生理功能還不清楚，有研究提示該蛋白與神經(jīng)元的突觸可塑性有關。另有研究發(fā)現(xiàn)其可能是信號轉(zhuǎn)導過程中的重要成員。過去的幾年中，許多研究證實α-SYN在Lewy小體病和帕金森病的發(fā)病機制中起到了關鍵的作用，然而α-SYN在錳神經(jīng)毒性作用

3、中的機制尚不清楚。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及胞核內(nèi)的過程中，通過絲/蘇氨酸磷酸化，參與細胞增殖、分化及凋亡等極其重要的生物學反應。其中，ERK信號轉(zhuǎn)導通路主要參與細胞增殖與分化的調(diào)控。而JNK及p38通路多在應激條件下激活，可能與細胞應激時的多種病理生理過程有關，而且并行的MAPKs信號通路相互協(xié)調(diào)、相互調(diào)控。 近年來，錳神經(jīng)細胞毒性作用的研究受到了廣泛關注。初步的研究結果認為較低劑

4、量的錳(0.03mM)短時間作用于神經(jīng)細胞，其磷酸化ERK表達水平增高，但也有降低的報道，同時錳引發(fā)了磷酸化JNK表達水平的升高。24h和48h的細胞生存活力實驗表明錳可使細胞增殖抑制。由于實驗條件不同，研究結果不盡一致。 基于以往的實驗事實，我們以多巴胺能的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12為實驗模型，研究錳對多巴胺能神經(jīng)細胞的毒性作用。篩選錳對PC12細胞增殖抑制作用的時間及劑量關系，探討在此過程中α-SYN蛋白表達水平的變化及其引

5、起細胞毒性的可能機制，旨在尋找錳等PD相關環(huán)境危險因子對基底神經(jīng)節(jié)損傷作用的分子機制，以期揭示錳中毒等神經(jīng)退行性疾病的病因?qū)W基礎，為臨床預防和治療錳中毒及其他神經(jīng)退行性疾病提供一定的實驗依據(jù)。 實驗方法取對數(shù)生長期PC12細胞，使用含有0、100、300、500、700、900μmol/LMnCl2的DMEM培養(yǎng)液，分別作用1-7天后，用噻唑藍(MTT)比色試驗和平板克隆形成實驗檢測細胞的生長和增殖情況，臺盼藍染色法繪制細胞生長

6、曲線，篩選錳的細胞毒性劑量；Westernblot法檢測染錳后細胞α-SYN表達水平的變化；用pcDNA3.1(+)-sense-α-syn質(zhì)粒和pcDNA3.1(-)-antisense-α-syn質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC12細胞，MTT法觀察α-SYN蛋白表達水平的變化在錳誘導的PC12細胞毒性中的作用；Westernblot法檢測染錳后PC12細胞ERK1/2和JNK1/2蛋白磷酸化水平的變化；采用ERK和JNK通路阻斷劑抑制ERK和JN

7、K蛋白磷酸化水平后westernblot法檢測α-SYN表達水平的變化；并用westernblot法檢測α-SYN蛋白表達水平的變化對染錳PC12細胞中ERK1/2和JNK1/2蛋白磷酸化水平的影響。 實驗結果MTT和平板克隆形成實驗檢測結果顯示100-900μmol/LMnCl2作用1-7天均對PC12細胞有抑制作用，且呈劑量和時間依賴關系，而且300μmol/LMnCl2作用3天對PC12細胞的抑制率可達50％(P＜0.05

8、)。Westernblot結果顯示100、300、500μmol/LMnCl2作用3天可見隨著染錳濃度的升高，α-SYN蛋白表達水平逐漸升高，與對照組相比，蛋白表達水平分別升高了1.82、4.52、7.34倍(P＜0.05)。 將pcDNA3.1(+)-sense-α-syn和pcDNA3.1(-)-antisense-α-syn分別轉(zhuǎn)染至PC12細胞中，觀察α-SYN表達水平的改變對錳神經(jīng)毒性的影響，結果顯示，與對照組細胞相比

9、，α-SYN含量增加對PC12細胞的生長增殖有抑制作用(P＜0.05)，α-SYN含量增加可加重錳對PC12細胞的生長增殖抑制(P＜0.05)，而α-SYN含量降低則可減輕錳對PC12細胞的生長增殖抑制(P＜0.05)。 100、300、500μmol/LMnCl2作用3天可見ERK1/2磷酸化水平逐漸降低，蛋白表達水平分別為對照組的61.6％、46.8％、24.4％(P＜0.05)，呈逐漸降低趨勢；JNK1/2磷酸化水平逐漸升

10、高，蛋白表達水平分別比對照組升高了1.91、2.86、4.13倍(P＜0.05)；提示ERK1/2磷酸化水平的降低和JNK1/2磷酸化水平的增高引起細胞增殖抑制。用ERK和JNK通路特異性阻制劑PD98059和SP600125預處理細胞，結果顯示對α-SYN表達沒有顯著影響(P＞0.05)。300μmol/LMnCl2作用3d時，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-sense-α-syn的染錳PC12細胞隨著α-SYN表達的增高(為對照組的1.

11、25倍，P＜0.05)，與對照組相比，p-ERK1/2表達水平降低(為對照組的34.7％，P＜0.05)，p-JNK1/2表達水平升高(為對照組的4.21倍，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-antisense-α-syn質(zhì)粒的染錳PC12細胞隨著α-SYN表達水平的降低(為對照組的31.5％，P＜0.05)，與對照組相比，p-ERK1/2表達水平升高(為對照組的4.22倍，P＜0.01)，p-JNK1/2表達水平降低(為對照

12、組的39.7％，P＜0.05)，提示染錳PC12細胞α-SYN表達水平的變化可能誘導了p-ERK1/2及p-JNK1/2表達水平的變化，繼之誘導細胞毒性。 結論一定濃度的錳對PC12細胞生長、增殖具有顯著的抑制作用，誘導α-SYN表達增高可能是錳的神經(jīng)毒作用機制之一。我們的研究結果提示α-SYN表達水平的升高對PC12細胞的生長增殖具有抑制作用，而誘導α-SYN表達水平增高可能在MnCl2引起的多巴胺能神經(jīng)細胞毒性中起重要作用，