1、一、研究背景和目的
　　 腸出血型大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是一種新現(xiàn)腸道傳染病致病菌，能引起出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)和血栓性血小板減少性紫癜（Thrombotic thromobocytopenie porpura, TTP）等。1

2、983年，Riley等首次報(bào)道了美國(guó)EHEC O157∶H7引起的嚴(yán)重食源性疾病——出血性結(jié)腸炎。此后，由EHEC O157∶H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)在世界范圍內(nèi)不斷發(fā)生。1986年，我國(guó)首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到EHEC O157∶H7，已有十余個(gè)省份從食品、家畜家禽和腹瀉患者糞便中分離到該菌。目前，EHEC O157∶H7的感染呈暴發(fā)流行趨勢(shì)，具有較強(qiáng)的傳染性與致病性，對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

3、r>　　 EHEC O157∶H7的致病作用主要通過(guò)產(chǎn)生志賀樣毒素(STX)和細(xì)菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞黏附-抹去損傷（attaching and effacing lesion，A/E損傷）完成。O157∶H7能產(chǎn)生致死性志賀毒素(Stx)，由前噬菌體上的slt基因編碼，是產(chǎn)Vero毒素大腸埃希菌（Vcrocytotoxin-producing E.coli，VTEC）區(qū)別于其它大腸桿菌的顯著特點(diǎn)。引起A/E損傷的主要毒力基因位于染色體腸

4、細(xì)胞脫落位點(diǎn)(the locus of enterocyteeffacement，LEE)毒力島。LEE毒力島由5個(gè)操縱子組成，編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)、轉(zhuǎn)位蛋白(EspA，EspB，and EspD)、效應(yīng)蛋白(Tir, EspG，EspF，Map和EspH)、緊密黏附素(intimin)、分子伴侶(CesAB，CesD，CesD2，CesF和CesT)和調(diào)控子(Ler，GrlA和GrlR)等。esp基因位于LEE4操縱子末端，編

5、碼分泌效應(yīng)蛋白EspF（EHEC-secreted protein F）。目前，EHEC O157∶H7感染致病的效應(yīng)蛋白已增加到20多種，其中EspF的作用范圍最廣，是多功能性的。腸致病型大腸埃希菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）的有關(guān)研究表明，EspF可與線粒體、核仁及細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白分子結(jié)合，導(dǎo)致上皮細(xì)胞緊密連接破壞、微絨毛消失、細(xì)胞骨架重排、墊狀結(jié)構(gòu)( pedestal)形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。學(xué)術(shù)界認(rèn)

6、為，分泌蛋白EspF對(duì)于研究A/E病原體致病作用的分子機(jī)制舉足輕重，甚至將其稱為細(xì)菌性病原體致病的“瑞士軍刀”。
　　 雖然，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)EPEC中EspF蛋白在細(xì)胞特異性A/E損傷中的作用進(jìn)行了深入研究，但是EHEC中EspF蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍然不甚清楚，破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接導(dǎo)致腸屏障功能喪失的動(dòng)力學(xué)機(jī)制也不清楚。那么EHECO157∶H7中，EspF蛋白是否具有破壞細(xì)胞屏障功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡呢？EHECO157∶

7、H7侵襲黏附宿主上皮細(xì)胞后是否影響腸上皮細(xì)胞緊密連接，導(dǎo)致腸粘膜改變或脫落而導(dǎo)致細(xì)胞黏附-抹去損傷？EspF蛋白哪個(gè)功能域在起作用呢？
　　 本實(shí)驗(yàn)的前期研究中，我們選取espF基因N端48-204bp序列作為敲除對(duì)象，采用重疊延伸PCR(OL-PCR)和同源重組技術(shù)，成功構(gòu)建了espF基因N端缺失突變株EHEC O157∶H7(△espF)。細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，espF基因的缺失減弱了細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力和細(xì)胞毒性

8、作用，但不影響細(xì)菌的生物學(xué)特性。本研究擬在已構(gòu)建的△esp突變株的基礎(chǔ)上，利用EHEC O157∶H7野生型菌株和△espF突變株分別感染結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞和BALB/c小鼠，采用免疫印跡法檢測(cè)感染細(xì)胞的Caspase家族凋亡蛋白酶-9/-3活性，采用TUNEL試驗(yàn)法檢測(cè)體外感染細(xì)胞凋亡情況，比較EHEC野生型菌株和突變株感染后小鼠死亡率、結(jié)腸形態(tài)、結(jié)腸重量和結(jié)腸黏附細(xì)菌數(shù)量，熒光顯微鏡觀察結(jié)腸粘膜改變和細(xì)菌黏附情況。從蛋白分子、細(xì)胞水

9、平和動(dòng)物感染模型著手，揭示EspF蛋白在EHECO157∶H7導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞黏附-抹去損傷過(guò)程中的細(xì)胞凋亡作用。
　　 此外，本研究還采用PCR鑒定技術(shù)、細(xì)菌黏附性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞LDH釋放實(shí)驗(yàn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集的18株EHEC O157∶H7流行菌株進(jìn)行毒力鑒定，為后續(xù)EHEC致病機(jī)制研究篩選毒力菌株提供理論依據(jù)。
　　 二、研究方法
　　 1.EHEC O157∶H7 EspF蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的研究
　　 (

10、1) Lovo細(xì)胞中Caspase-9/3凋亡蛋白檢測(cè)根據(jù)Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟，用EHEC O157∶H7野生型菌株(WT)、espF基因缺失突變菌株(△espF)和放線菌素D(Act-D)分別處理Lovo細(xì)胞3h，激活Caspase家族蛋白酶-9/-3的活性。細(xì)胞裂解后提取蛋白，SDS-PAGE分離目的蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，用Caspase-9抗體和Caspase-3抗體孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，

11、凝膠成像儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白分泌情況。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，選擇微管蛋白Tubulin作為內(nèi)參對(duì)照，調(diào)節(jié)各組樣本量。
　　 (2) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) EHEC O157∶H7 WT、△espF菌株和Act-D分別處理Lovo細(xì)胞3h，并設(shè)置空白對(duì)照組。PBS漂洗，樣品經(jīng)固定、封閉、通透后，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒染色，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　 (3) EHEC

12、感染小鼠導(dǎo)致結(jié)腸A/E損傷的研究EHEC O157∶H7 WT、△espF和LB培養(yǎng)基分別灌胃接種BALB/c小鼠。第一批實(shí)驗(yàn)小鼠感染后飼養(yǎng)20天，觀察小鼠生長(zhǎng)和存活情況。另一批實(shí)驗(yàn)小鼠于感染第七天處死，觀察結(jié)腸形態(tài)、水腫等病理特征，稱量結(jié)腸重量，涂板計(jì)數(shù)結(jié)腸黏附細(xì)菌數(shù)量。結(jié)腸經(jīng)4％多聚甲醛固定、30％蔗糖溶液脫水后制作冰凍切片，切片經(jīng)固定、通透后，用抗EHECO157∶H7抗體和羅丹明-鬼筆環(huán)肽進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)腸粘膜損傷和

13、細(xì)菌黏附情況。
　　 2.EHEC O157∶H7流行菌株的毒力鑒定
　　 根據(jù)E-hlyA，stx2, stx1基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR檢測(cè)不同地區(qū)發(fā)生EHECO157∶H7暴發(fā)流行菌株的毒力基因;不同菌株感染Vero細(xì)胞3h，Giemsa染色觀察細(xì)菌對(duì)Vero細(xì)胞的黏附性;GENMED乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同細(xì)菌作用細(xì)胞后釋放的LDH，通過(guò)計(jì)算LDH釋放率

14、，比較不同菌株的細(xì)胞毒性作用強(qiáng)弱。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析方法
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS13.0軟件，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和結(jié)腸重量采用單向方差分析(One-WayANOVA)，各組均數(shù)的多重比較(Multiple Comparisons)采用LSD法（Least-significant Difference，最小顯著差值法）;結(jié)腸黏附細(xì)菌計(jì)數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢

15、驗(yàn)(Independent-Samples T test); LDH釋放率采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。
　　 三、結(jié)果
　　 1.espF突變株導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的能力比野生株低
　　 Lovo細(xì)胞感染后，EHEC野生株誘導(dǎo)組(WT)可見(jiàn)Caspase-9和Caspase-3清晰蛋白條帶，說(shuō)明Lovo細(xì)胞產(chǎn)生了Caspase-9/3凋亡蛋白，而espF基因缺陷突變株誘導(dǎo)組(△espF) Caspase-9/3蛋白條帶顏色比

16、WT組淺，說(shuō)明△espF感染細(xì)胞的凋亡蛋白表達(dá)水平低于WT組，但仍高于對(duì)照組。其次，各組的Caspase-3蛋白條帶顏色深于Caspase-9，說(shuō)明感染細(xì)胞可能進(jìn)入了凋亡后期。凋亡誘導(dǎo)劑放線菌素D(Act-D)處理組蛋白條帶顏色與WT組相仿，空白對(duì)照組也可見(jiàn)十分微弱的蛋白條帶。
　　 TUNEL法檢測(cè)Lovo細(xì)胞凋亡情況，WT和Act-D感染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了較嚴(yán)重的凋亡;△espF組

17、細(xì)胞綠色熒光較少，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也少于WT組，表明其細(xì)胞凋亡程度輕于WT組。空白對(duì)照組細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明未感染細(xì)胞無(wú)或極少發(fā)生凋亡。
　　 2.espF變株導(dǎo)致小鼠結(jié)腸A/E損傷程度比較野生株有所減輕
　　 野生株組、突變株組和對(duì)照組小鼠經(jīng)相應(yīng)細(xì)菌感染后，WT組小鼠病死率為30％，較△espF組高，小鼠腸道發(fā)生水腫，固化糞便較少，是細(xì)菌引起的出血性結(jié)腸炎的典型表現(xiàn);△espF組小鼠腸道較健康，帶有固化糞便，小

18、鼠無(wú)死亡。WT組感染小鼠結(jié)腸重量和黏附細(xì)菌數(shù)均高于△espF組小鼠。用小鼠抗EHECO157∶H7抗體和羅丹明鬼筆環(huán)肽，對(duì)結(jié)腸冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色觀察，WT組結(jié)腸腸腔變大，粘膜微絨毛損傷或脫落，部分腸隱窩消失，粘膜上皮細(xì)胞表面和隱窩內(nèi)可見(jiàn)大量綠色熒光;△espF組結(jié)腸粘膜損傷不明顯，腸隱窩結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞表面綠色熒光較少。說(shuō)明WT組感染小鼠腸道粘膜損傷程度和黏附細(xì)菌數(shù)均高于△espF組感染小鼠。
　　 3.EHEC O157

19、∶H7流行菌株的毒力不完全相同
　　 PCR鑒定結(jié)果顯示，18株細(xì)菌中14株含溶血素E-hlyA基因，14株含stx2基因，只有8株含stx1基因。細(xì)胞黏附試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有EHEC菌株黏附能力和細(xì)胞毒性均強(qiáng)于對(duì)照組，而且stx2基因表達(dá)蛋白的毒力強(qiáng)于stx1基因表達(dá)蛋白的毒力。其中中國(guó)流行菌株882364、01H112和日本流行菌株Cua9的Vero細(xì)胞毒性與國(guó)際菌株933W/O的細(xì)胞毒性接近，明顯高于其他菌株。

20、r>　　 四、結(jié)論
　　 1.espF基因N端序列缺失，使細(xì)菌的黏附性、細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力降低，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞破壞和A/E損傷程度減輕。表明EspF蛋白是細(xì)菌感染引起細(xì)胞凋亡的重要毒力因子之一，在腸上皮細(xì)胞的細(xì)菌定植和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序中至關(guān)重要。證實(shí)N端為EspF蛋白的功能區(qū)。
　　 2.EHEC不同菌株的毒力基因、細(xì)菌黏附力和Vero細(xì)胞毒性強(qiáng)弱不同，菌株882364、01H112、933W/O、Cua9毒力