1、第一章 人脂聯(lián)素基因的克隆和真核表達(dá) 目的：克隆人脂聯(lián)素基因(apMl)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDEF-apMl，檢測其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)水平，為脂聯(lián)素基因重組腺病毒的構(gòu)建和表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；并構(gòu)建球狀脂聯(lián)素(gAdiponectin)基因的真核表達(dá)載體，檢測其在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素、球狀脂聯(lián)素的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用RT-PCR法自人大網(wǎng)膜脂肪組織的總RNA中擴(kuò)增出ap

2、MlcDNA全長基因，采用T-A克隆法重組到pGEM-TVectorSystem中，通過藍(lán)白斑篩選出陽性克隆后，測序鑒定。用PCR法從測序正確的pGEM-T-apMl質(zhì)粒上，擴(kuò)增出兩端帶有sfiI酶切位點(diǎn)的人脂聯(lián)素基因，再將擴(kuò)增出的片斷亞克隆到T載體上，用sfiI酶切T載體和pCDEF空載體，將酶切后的片斷進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、測序。將成功構(gòu)建的pCDEF-apMl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中脂聯(lián)

3、素的表達(dá)水平。以構(gòu)建好的質(zhì)粒pGEMT-apMl為模板，PCR擴(kuò)增出兩端帶有XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)的人球狀脂聯(lián)素基因，將PCR產(chǎn)物和pcDEF／PPT-myc-His(一)A載體雙酶切后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、測序。將成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，Westernblot檢測上清液中人球狀脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：從脂肪組織總RNA中擴(kuò)增得到735bpapMl基因，其cDNA序列與GenBank報(bào)導(dǎo)的人脂聯(lián)素基

4、因apMl同源性為99.7％(159位和558位堿基發(fā)生了無義突變)，獲得了質(zhì)粒pGEM-T-apMl，測序鑒定正確。構(gòu)建的pCDEF-apMl質(zhì)粒測序正確，能有效轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并在培養(yǎng)上清中檢測到較高水平的脂聯(lián)素蛋白。構(gòu)建的gAdiponectin基因的真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測序鑒定正確，并有效的轉(zhuǎn)染了HUVEC，經(jīng)Westernblot在上清中檢測到了該基因的表達(dá)。 結(jié)論：成功的克隆了apMl基因全長cDNA。構(gòu)建了

5、人脂聯(lián)素基因的真核表達(dá)載體pCDEF-apMl，并在HEK293細(xì)胞中獲得高效表達(dá)；成功的構(gòu)建并鑒定了人球狀脂聯(lián)素基因真核表達(dá)載體，在HUVEC細(xì)胞中獲得了分泌表達(dá)，為人脂聯(lián)素基因重組腺病毒的構(gòu)建和表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 第二章 人脂聯(lián)素基因重組腺病毒的構(gòu)建、鑒定和表達(dá) 目的：構(gòu)建含有人脂聯(lián)素基因apMl的重組腺病毒載體，制備能表達(dá)人脂聯(lián)素蛋白的重組腺病毒，為脂聯(lián)素用于體內(nèi)外干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化奠定基礎(chǔ)。 方法：自質(zhì)粒pG

6、EM-T-apMl上擴(kuò)增兩端帶有SalI和HindIII酶切位點(diǎn)的全長apMl基因，將PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV經(jīng)SalI和HindlII雙酶切后，連接、轉(zhuǎn)化、篩選，進(jìn)行PCR鑒定后送雙向測序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-apMl用PmeI酶切使其線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)BJ5183菌，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，篩選、鑒定、擴(kuò)增，PacI酶切后用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)

7、染低代數(shù)的HEK293包裝細(xì)胞，進(jìn)行包裝出毒，并用HeLa細(xì)胞檢測重組腺病毒的生物安全性。重組腺病毒進(jìn)行鑒定、擴(kuò)增后，測定病毒滴度，感染HUVEC、HepG2細(xì)胞，確定最佳MOI，觀察對(duì)HUVEC、HepG2細(xì)胞生長的影響，并用ELISA檢測上清中人脂聯(lián)素蛋白的水平，Westernblot檢測細(xì)胞中人脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-apMl經(jīng)PCR和測序鑒定正確，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1

8、同源重組成功，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，產(chǎn)生的病毒經(jīng)鑒定正確，并且無具有復(fù)制能力的腺病毒存在，生物安全性高，在HUVEC、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞中檢測到apMl基因的蛋白表達(dá)。 結(jié)論：成功的制備了apMl基因重組腺病毒，并在HUVEC和HepG2細(xì)胞中獲得分泌表達(dá)，可進(jìn)一步用于脂聯(lián)素干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬的研究。 第三章 人脂聯(lián)素基因重組腺病毒對(duì)HUVEC細(xì)胞的影響 目的：研究人脂聯(lián)素基因重組腺病毒對(duì)HUVEC細(xì)胞的

9、影響，觀察人脂聯(lián)素基因重組腺病毒保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和體外抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。 方法：用人脂聯(lián)素基因重組腺病毒感染HUVEC細(xì)胞，雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中人脂聯(lián)素、IL-10的表達(dá)水平，Westernblot檢測人脂聯(lián)素蛋白、MCP-1、ICAM-1、iNOS、eNOS蛋白表達(dá)，比色法檢測總NOS、iNOS、eNOS活力，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平。 結(jié)果：用含報(bào)告基因LacZ的

10、對(duì)照腺病毒(Ad-LacZ)感染HUVEC細(xì)胞，檢測腺病毒的感染效率，確定最佳MOI為50，用MOI為50的人脂聯(lián)素基因重組腺病毒感染HUVEC細(xì)胞，24h、48h、72h后取上清檢測脂聯(lián)素濃度分別為140±9ng/ml、185±8ng/ml、170±10ng/ml。感染了Ad-apMl的HUVEC細(xì)胞上清總NO、IL-10水平顯著升高；總NOS和eNOS的活力和蛋白表達(dá)顯著升高，而iNOS的活力和蛋白表達(dá)顯著降低。感染了Ad-apMl

11、的HUVEC細(xì)胞SOD的活力顯著升高，而產(chǎn)生的丙二醛含量顯著降低。感染了Ad-apMl的HUVEC細(xì)胞MCP-1和ICAM-1蛋白表達(dá)顯著降低。 結(jié)論：我們制備的重組腺病毒能有效感染HUVEC細(xì)胞并分泌表達(dá)人脂聯(lián)素蛋白，可上調(diào)HUVEC細(xì)胞總NO、總NOS和eNOS的活力和蛋白表達(dá)，下調(diào)iNOS的活力和蛋白表達(dá)，具有抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。而且還能使具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的細(xì)胞因子IL．10的表達(dá)水平顯著升高，下調(diào)黏附分