1、目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease， AD)是一種年齡相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，最終發(fā)展為進行性癡呆，AD的主要神經(jīng)病理特征是細胞外存在大量由β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protien，Aβ)高度聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元缺失以及皮質(zhì)動脈和小動脈的血管淀粉樣變性。其發(fā)病

2、原因復雜，至今尚未完全闡明。目前認同的觀點是:Aβ的水平是由其產(chǎn)生和清除之間的平衡決定的;Aβ在腦內(nèi)的沉積是AD發(fā)病的早期過程和中心環(huán)節(jié)。發(fā)病早期活化的小膠質(zhì)細胞可以清除Aβ，隨著病情進展，這種由小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應將成為慢性的神經(jīng)毒性，產(chǎn)生大量的有害因子，導致神經(jīng)元死亡。
　　總體來說，Aβ的水平是由其產(chǎn)生和清除之間的平衡決定的，若Aβ的清除障礙導致腦內(nèi)形成沉積斑塊。
　　巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞是體內(nèi)固有的免疫細胞，可以

3、清除病原體及有害代謝產(chǎn)物，有研究顯示AD病人的血源性單核/巨噬細胞能夠穿過血腦屏障遷移入腦，但不能有效清除炎性斑塊內(nèi)的Aβ。而AD患者腦內(nèi)固有的小膠質(zhì)細胞雖然呈現(xiàn)炎癥、吞噬及致炎反應的特征，但并不具備吞噬能力。以APP轉基因小鼠為模AD型進行的研究表明，絕大多數(shù)浸潤到腦內(nèi)Aβ斑塊周圍的小膠質(zhì)細胞來源于骨髓;而非腦內(nèi)固有小膠質(zhì)細胞。由此看來，AD患者及APP轉基因小鼠腦內(nèi)固有的小膠質(zhì)細胞雖然對Aβ沉積呈現(xiàn)出了炎性反應，而血源性巨噬細胞卻不

4、能有效清除Aβ。所以得出結論:AD患者先天性免疫功能缺陷可能是腦內(nèi)Aβ沉積引發(fā)炎性反應的主要原因。
　　發(fā)病早期，小膠質(zhì)細胞在AD病人腦內(nèi)聚集能夠促進Aβ的清除、延緩病情進展，然而盡管隨著病情進展，入腦的小膠質(zhì)細胞數(shù)量不斷增加，但最終還是形成Aβ斑塊，提示這些遷移入腦的骨髓源性小膠質(zhì)細胞對于Aβ的清除能力有所下降。
　　那么對于AD患者，其外周血單核細胞為什么不能同樣有效地清除Aβ從而達到限制病程進展的目的？我們通過采集30

5、個AD患者及26個同年齡健康對照者的外周血并分離單核細胞，進行mRNA的基因芯片分析，旨在對AD病人和正常老年人外周血單核細胞基因表達譜的差異進行研究，同時篩選有意義的基因，研究其在AD病人外周血單核細胞表達異常的病理意義。
　　方法：
　　1、篩選AD病人及同年齡健康對照者外周血單核細胞中表達差異的基因
　　(1) AD病人外周血單核細胞的分離:選取沈陽地區(qū)AD病30例，同年齡健康對照26例，用肝素抗凝處理過的試管，

6、于清晨空腹采肘靜脈血，室溫放置，采血后3h內(nèi)用分離人外周血單核細胞的Dynabeads(R)CD14磁珠試劑盒分離人外周血單核細胞，用Trazol裂解后提取總RNA并委托公司進行基因芯片檢測。
　　(2)根據(jù)芯片檢測結果，篩選有表達差異的基因，并選取其中的Cathepsin D和Cystatin F基因進行研究。
　　2、AD病人外周血單核細胞Cathepsin D表達異常對Aβ降解的影響
　　(1)采用定量PCR方法

7、驗證AD病人外周血單核細胞中Cathepsin D基因表達的變化。
　　(2)分別采集5個AD病人及5個健康對照者外周血，免疫磁珠法分離人外周血單核細胞，用Cathepsin D activity assay kit測定Cathepsin D活性變化。
　　(3)以Cathepsin D的抑制劑Pepstatin A處理THP-1和U937后，觀察其活性變化。
　　(4)采用ELISA方法檢測Pepstatin A處理

8、后THP-1對于Aβ的降解的影響。
　　(5)利用慢病毒載體，構建特異性Cathepsin D基因沉默的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒。
　　(6)用慢病毒顆粒轉染單核細胞THP-1，建立Cathepsin D基因低表達的單克隆細胞系。
　　(7)采用ELISA方法檢測低表達Cathepsin D的單核細胞對于Aβ降解的影響。
　　(8)采用免疫組化方法分析低表達Cathepsin D單核細胞對于AP

9、P/PS1小鼠腦片內(nèi)Aβ清除的影響。
　　3、探討Cathepsin D基因表達異常是否為代償性改變
　　(1)利用本課題組建立的腦內(nèi)沉積Aβ的大鼠動物模型（即在大鼠海馬部位注入Aβ1-42后成功觀察到大鼠腦內(nèi)Aβ沉積），我們在大鼠海馬部位注入Aβ1-42術后3d和7d分別采集外周血并分離單核細胞。
　　(2)采用定量PCR方法檢測大鼠外周血單核細胞中Cathepsin D表達的變化。
　　4、AD病人外周血單核

10、細胞Cystatin F基因表達異常對Aβ降解的影響
　　(1)采用定量PCR方法驗證AD病人外周血單核細胞中Cystatin F表達的變化。
　　(2)利用慢病毒載體，構建特異性Cystatin F基因沉默的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒。
　　(3)利用慢病毒載體，構建特異性Cystatin F基因高表達的RNA干擾質(zhì)粒，制備得到高滴度的慢病毒顆粒。
　　(4)用慢病毒顆粒轉染單核細胞的模式細胞U

11、937/THP-1，建立Cystatin F基因沉默或高表達的單克隆細胞系。
　　(5)采用ELISA方法檢測特異性Cystatin F基因沉默對于Aβ降解的影響。
　　(6)采用免疫組化方法檢測特異性Cystatin F基因過表達對于APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ清除的影響。
　　結果：
　　1、篩選出AD病人和同年齡對照者外周血單核細胞中表達差異的基因
　　(1)與同齡對照者相比，AD病人Cathepsin

12、 D基因表達下調(diào)、活性下降。
　　(2)與同齡對照者相比，AD病人Cystatin F基因表達上調(diào)。
　　2、 Cathepsin D表達下調(diào)不利于單核細胞對Aβ的降解
　　(1)經(jīng)Cathepsin D抑制劑Pepstatin A處理后，THP-1/U937中Cathepsin D活性下降。
　　(2)Pepstatin A能抑制THP-1/U937對于Aβ的降解。
　　(3)慢病毒介導特異性Cathep

13、sin D基因沉默THP-1單克隆細胞株對于Aβ的降解能力下降。
　　(4)慢病毒介導特異性Cathepsin D基因沉默THP-1單克隆細胞對于AD小鼠腦片內(nèi)Aβ斑塊的清除能力下降。
　　(5)腦內(nèi)沉積Aβ的大鼠動物模型外周血單核細胞中Cathepsin D表達無明顯變化。
　　3、 Cystatin F表達異常能夠影響U937/THP-1對于Aβ的降解
　　(1)慢病毒介導特異性Cystatin F基因沉默U

14、937單克隆細胞株對于外源性Aβ的降解能力下降。
　　(2)慢病毒介導Cystatin F高表達THP-1單克隆細胞株能促進對外源性Aβ的降解。
　　(3)慢病毒介導特異性Cystatin F基因過表達THP-1單克隆細胞有助于AD小鼠腦片內(nèi)Aβ斑塊的清除
　　結論：
　　1、 AD患者外周血單核細胞中Cathepsin D表達下調(diào)、活性下降，而Cystatin F表達上調(diào);
　　2、 Cathepsin