1、隨著抗生素的廣泛使用,耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生開始引起全世界的廣泛關(guān)注。這使得人們開始重新考慮利用噬菌體治療細(xì)菌感染,即噬菌體治療。噬菌體是細(xì)菌的天然殺手,能夠與抗生素聯(lián)合使用治療耐藥性細(xì)菌引起的感染,是解決抗生素耐藥性問題的最佳選擇之一。在噬菌體治療過程中,細(xì)菌往往會(huì)對噬菌體產(chǎn)生耐受,導(dǎo)致耐受噬菌體的菌株出現(xiàn),從而影響噬菌體治療效果。細(xì)菌對來自噬菌體的攻擊已進(jìn)化了多種防御機(jī)制,如抑制吸附、流產(chǎn)感染系統(tǒng)(abortive infection s

2、ystem)、限制-修飾系統(tǒng)、CRISPR系統(tǒng)等。噬菌體在抵御細(xì)菌的防御機(jī)制的同時(shí)也進(jìn)化了相應(yīng)的策略來逃避宿主的防御,噬菌體和細(xì)菌在相互作用的過程中共同進(jìn)化。
　　規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)存在于40％細(xì)菌和90%古細(xì)菌基因組中,由重復(fù)序列(direct repeat,DR)和長度相似的非重復(fù)的間區(qū)序列

3、(spacer)間隔排列組成一個(gè)單元形成 CRISPR簇,是細(xì)菌內(nèi)存在的專門針對噬菌體及質(zhì)粒等外源基因的獲得性免疫系統(tǒng),這種抗性作用的發(fā)揮類似于真核生物中的RNA干擾作用。CRISPR對于細(xì)菌產(chǎn)生對噬菌體的耐受具有重要的影響。
　　本課題擬研究大腸桿菌耐受噬菌體的作用機(jī)制,尤其是CRISPR系統(tǒng)與細(xì)菌耐受噬菌體之間的相互關(guān)系。為開展這項(xiàng)工作,我們通過PCR方法篩選含有CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌,分析這些大腸桿菌 CRISPR系統(tǒng)的

4、特征。然后以含有 CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌為指示菌,從醫(yī)院污水中分離相關(guān)的噬菌體,進(jìn)而篩選出耐受噬菌體的大腸桿菌突變株。完成敏感菌和耐受菌的全基因組測序,對兩株細(xì)菌基因組序列比較分析,尋找耐受菌中是否有單堿基突變、序列插入、缺失等,研究噬菌體耐受菌對噬菌體產(chǎn)生耐受的機(jī)制。
　　根據(jù)CRISPR database數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的大腸桿菌的CRISPR序列的信息,我們設(shè)計(jì)了4對特異性的引物,采用 PCR的方法檢測到42株大腸桿菌中

5、含有CRISPR序列,并對所擴(kuò)增的CRISPR序列的特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,在大腸桿菌CRISPR序列中,DR序列基本一致,spacer序列則具有多態(tài)性。然后選用其中一株大腸桿菌 E.coli147-30作為指示菌,自醫(yī)院污水中分離得到了一株噬菌體IME-EC1,在噬菌體的選擇壓力下,篩選得到了噬菌體 IME-EC1的耐受菌E.coli147-30R,在此基礎(chǔ)上又分離得到其可裂解耐受菌E.coli147-30R的噬菌體IME-EC2,

6、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IME-EC2不能裂解E.coli147-30。在耐受菌的CRISPR序列中,發(fā)現(xiàn)沒有新的間隔序列的插入,推測大腸桿菌耐受菌E.coli147-30R對噬菌體IME-EC1的抗性不是由于間隔序列的插入而導(dǎo)致的。為進(jìn)一步分析耐受產(chǎn)生的機(jī)制,我們對IME-EC1敏感菌E.coli147-30和耐受菌E.coli147-30R進(jìn)行了全基因組測序,通過全基因組序列比較分析,發(fā)現(xiàn)耐受菌中存在序列的插入、缺失現(xiàn)象。其中最大的一處差異是由于