1、研究目的： （1）驗(yàn)證高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中存在細(xì)胞凋亡的增加，明確凋亡在高血壓致心肌功能障礙過程中發(fā)揮的作用。 （2）明確高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中是否存在ERS的激活。 （3）明確高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中是通過哪條或哪幾條與ERS相關(guān)的途徑介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。 （4）明確AT1受體拮抗劑是否通過參與調(diào)節(jié)ERS發(fā)揮逆轉(zhuǎn)左室肥厚、延緩心衰的出現(xiàn)和發(fā)展的作用。 研究

2、方法： 1、動(dòng)物模型構(gòu)建 1.1高血壓所致左室肥厚以及左室舒張功能障礙模型的建立：購買普通Wistar-Kyoto大鼠30只和自發(fā)性高血壓大鼠30只。隨機(jī)各取10只8周齡SHRs和10只。WKY大鼠處死后保留心臟標(biāo)本，余給予普通飼料分別喂養(yǎng)至16周、32周。應(yīng)用超聲心動(dòng)圖等技術(shù)判定各組大鼠左室肥厚程度以及左室舒張功能。大鼠符合實(shí)驗(yàn)要求后全部處死，留取標(biāo)本。 1.2纈沙坦的干預(yù)實(shí)驗(yàn)：選用SHRs和WKY大鼠為研究對

3、象。購買普通WKY大鼠10只和SHRs20只。隨機(jī)選取10只SHRs大鼠，給予纈沙坦進(jìn)行藥物干預(yù)，其余大鼠均給予等量生理鹽水，1次/d。所有大鼠均普食喂養(yǎng)至32周，全部處死后留取標(biāo)本。 2、大鼠收縮壓的測定 大鼠40℃預(yù)熱5-10分鐘，采用RBP-1型大鼠無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測定分析系統(tǒng)，測量大鼠安靜、清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓和心率，連測三次，取其平均值。 3、大鼠左室重量指數(shù)的比較：LVMI=左心室重量。用分析天平稱取

4、LVM，計(jì)算LVMI。 4、超聲心動(dòng)圖檢測：分別于高血壓左室肥厚、左室舒張功能障礙建模前以及建模后進(jìn)行常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢查。測定如下指標(biāo)：室間隔和左室后壁厚度；左室射血分?jǐn)?shù)；左室短軸縮短率；二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E/A比值和等容舒張時(shí)間并觀察瓣膜返流情況。 5、心肌組織病理學(xué)檢查：大鼠處死后，進(jìn)行組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)并拍片。 6、TUNEL染色

5、法鑒定凋亡細(xì)胞：取組織切片，進(jìn)行TUNEL染色，觀察細(xì)胞凋亡水平。 7、免疫組織化學(xué)檢測：取組織切片，進(jìn)行GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12、Caspase-3的免疫組織化學(xué)檢測。所用一抗分別為：GRP78多克隆抗體（SantaCruz公司，1：200稀釋）；CHOP多克隆抗體（SantaCruz公司，1：200稀釋）；p-JNK多克隆抗體（SantaCruz公司，1：300稀釋）；Caspase-12多克隆

6、抗體（SantaCruz公司，1：100稀釋）：Caspase-3多克隆抗體（SantaCruz公司，1：150稀釋）。 8、免疫印跡檢測：取左室組織，提取總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、ECL顯色等步驟，檢測GRP78、CHOP、p-JNK、JN-K、Caspase-12、Caspase-3的蛋白表達(dá)。 9、reaI time RT-PCR法檢測：分別從左室組織提取總RH

7、A，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）得到cDNA，以GAPDH作為參照，通過real time RT-PCR技術(shù)檢測GRP78、CHOP、P-JNK、Caspasc-12 mRNA的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況及血壓檢測 （1）最終全部大鼠完成了實(shí)驗(yàn)。SHRs血壓呈持續(xù)升高趨勢。與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡、16周齡、32周齡組SHRs的血壓均顯著升高（P<0.05）。 （2）32周齡纈沙坦干預(yù)組大鼠

8、較32周齡組SHRs血壓顯著降低（P<0.05），與32周齡組WKY大鼠相較無顯著性差異。 2、左室重量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）的比較 （1）與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡組SHRs的LVMI未見明顯變化；16周齡、32周齡組SHRs的LVMI均顯著增加（P

9、。 （2）32周齡纈沙坦干預(yù)組大鼠較32周齡組SHRs的LVMI顯著降低（P<0.05）。 3、超聲心動(dòng)圖檢測 （1）選用IVS和LVPW評價(jià)大鼠的左室肥厚程度；E/A比值、IVRT評價(jià)大鼠左室舒張功能；EF、FS評價(jià)大鼠左室收縮功能。與同周齡的WKY大鼠相比，16周齡和32周齡組SHRs的IVS和INPW均明顯增加（P<0.05）；16周齡組SHRs的IVRT明顯延長（P<0.05），E/A比值明顯降低（P<0

10、.05）；32周齡組SHRs的E/A比值顯著增加（E/A>>2），出現(xiàn)左室舒張功能障礙的E/A比值變化趨勢：早期降低，晚期升高，提示32周齡組的SHRs大鼠的心臟舒張功能已明顯受損。EF以及FS在各組大鼠間均無顯著性差異。 （2）同樣選用上述指標(biāo)評價(jià)表明：纈沙坦干預(yù)組大鼠較同周齡的SHRs相比，IVS和LVPW，E/A比值以及IVRT均顯著降低（P<0.05）；EF以及FS在兩組間均無顯著性差異。 4、光鏡標(biāo)本觀察（HE

11、染色） （1）HE染色顯示，對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻；8周齡組SHRs與對照組比較未見顯著性變化，仍可見心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻；16周齡組SHRs心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核出現(xiàn)增大、畸形等改變，肌纖維排列較紊亂；32周齡組SHRs可出現(xiàn)心肌細(xì)胞的變性，呈局灶性、片狀壞死，心肌纖維粗大、斷裂等。微血管管壁增厚，官腔狹小，管周纖維組織增多。 （2）較32周齡組SHRs相比，3

12、2周齡纈沙坦干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞肥大，輕度變性，心肌纖維無斷裂，心肌細(xì)胞核形狀略不整，微血管管壁、管腔均正常，肌纖維排列較整齊。 5、TUNEL染色 （1）與同周齡的WKY大鼠相比，8周齡組SHRs的心肌細(xì)胞凋亡無明顯增加；16周齡組SHRs的心肌細(xì)胞凋亡明顯增加（P<0.05）；32周齡組SHRs的心肌細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.01）。與8周齡組的SHRs相比，16周齡、32周齡組SHRs心肌細(xì)胞凋亡均顯著增加（P<0.

13、05，P<0.01）。 （2）較32周齡組SHRs相比，32周齡纈沙坦干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。 6、免疫組織化學(xué)檢測 （1）GRP78、CHOP、Caspase-12、Caspase-3蛋白均定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈淺棕色顆粒。與同周齡的WKY大鼠相比，各組SHRs心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)均顯著增加（P<0.05）；Caspase-12、Caspase-3蛋白只在16

14、周齡和32周齡組SHRs心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的表達(dá)顯著增加（P<0.05）；p-JNK蛋白的表達(dá)在各組間未見明顯差異。 （2）較32周齡組SHRs相比，纈沙坦干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的GRP78、CHOP、Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著減少（P<0.05）；p-JNK和Caspase-12蛋白表達(dá)未見明顯變化。 7、免疫印跡檢測 （1）與同周齡的WKY大鼠相比，各組SHRs心肌組織的GRP78、CHOP蛋白表達(dá)均顯著

15、增加（P<0.05，P<0.01）；Caspase-12和Caspase-3蛋白只在16周齡和32周齡組SHRs心肌組織中表達(dá)增多（P<0.05，P<0.01）；JNK和p-JNK的蛋白表達(dá)各組間均無顯著差異。 （2）較32周齡組SHRs相比，32周齡纈沙坦干預(yù)組大鼠心肌組織蛋白GRP78、CHOP的蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）。Caspase-12的蛋白表達(dá)兩組間未見明顯變化。 8、teaI time RT-POR

16、法檢測 （1）與同周齡的WKY大鼠相比，各組SHRs心肌組織的GRP78、CHOP mRNA表達(dá)均顯著增加（P<0.05，P<0.01）；Caspase-12 mRNA表達(dá)只在16周齡和32周齡組SHRs心肌組織中明顯增多（P<0.01）；p-JNK mRNA表達(dá)在各組間無顯著變化。 （2）較32周齡組SHRs相比，32周齡纈沙坦干預(yù)組大鼠心肌組織的GRP78、CHOP mRNA表達(dá)顯著減少（P<0.05）；Caspas

17、e-12 mRNA表達(dá)兩組間未見顯著變化。 研究結(jié)論： （1）驗(yàn)證了高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中存在心肌細(xì)胞凋亡的增加，證實(shí)凋亡在高血壓致心肌功能障礙過程中發(fā)揮重要作用。 （2）SHRs心肌組織GRP78的表達(dá)升高，證實(shí)高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中存在ERS的激活。 （3）SHRs心肌組織CHOP、Caspase-12表達(dá)增高，證實(shí)高血壓左室肥厚致左室舒張功能障礙過程中是通過ERS相關(guān)