1、目的：
　　Ghrelin是一種起效迅速的激素,主要在下丘腦和胃中表達(dá),通過與其特異性受體GHS-R結(jié)合,調(diào)控GH分泌和攝食。多項研究已證實ghrelin可多向性調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)穩(wěn)態(tài);在正常成年大鼠睪丸ghrelin主要表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞并可在睪丸局部抑制間質(zhì)細(xì)胞雄激素分泌;而瘦素缺失的雄性ob/ob小鼠不育,其血清雄激素濃度降低。已知leptin和ghrelin為參與體內(nèi)能量代謝中樞調(diào)節(jié)的一對相互拮抗關(guān)鍵分子,而能量代謝紊亂是導(dǎo)致精

2、子發(fā)生障礙的重要原因,據(jù)此我們推測后者在ob/ob雄性小鼠中可能通過調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞雄激素的生成進(jìn)而參與其不育表型的形成。為進(jìn)一步明確ghrelin在雄性ob/ob小鼠生殖中作用,我們研究了ghrelin及其受體GHS-R1α在WT、ob/ob小鼠中的表達(dá)變化,并對其可能的作用機制進(jìn)行了探討。
　　方法：
　　1.使用4％多聚甲醛固定的WT小鼠和ob/ob小鼠睪丸組織,進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色,了解ghrelin和GHS-

3、R1α在WT小鼠和ob/ob小鼠睪丸中的表達(dá)定位,使用蛋白質(zhì)免疫印跡、實時定量PCR進(jìn)一步研究ghrelin和GHS-R1α在睪丸的總體表達(dá)水平。
　　2.使用單劑量GHS-R1α的拮抗劑[D-Lys-3]-GHRP-60.1ml/10g腹腔注射ob/ob小鼠3天、7天、14天,建立ghrelin/GHS-R1α信號通路抑制小鼠模型,采用HE染色、PAS染色、免疫組織化學(xué)染色、TUNEL染色、蛋白質(zhì)免疫印跡、實時定量PCR研究睪丸

4、組織形態(tài)、生精周期、生精細(xì)胞凋亡等變化。
　　3.采用心臟取血,取ob/ob小鼠血液行RIA分析,并結(jié)合實時定量PCR分析雄激素合成限速酶的表達(dá)變化,檢測血清睪酮含量變化。
　　結(jié)果：
　　1.在WT和ob/ob小鼠睪丸中,ghrelin均表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì),ob/ob小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞ghrelin較WT小鼠相比,ghrelin免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈強陽性。蛋白質(zhì)印跡顯示ob/ob小鼠睪丸中g(shù)hrelin表達(dá)水平增高。

5、r>　　2.GHS-R1α在WT和ob/ob小鼠睪丸中均表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞及生精細(xì)胞,其中GHS-R1α染色陽性最強部位為長形精子。免疫組化和蛋白質(zhì)印跡發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠GHS-R1α表達(dá)水平顯著上升。
　　3.Ob/ob小鼠較WT小鼠相比,生精阻滯,生精細(xì)胞凋亡數(shù)目增加,生精周期紊亂。Ob/ob小鼠生精阻滯小管主要為兩類:一是停滯于減數(shù)分裂前;而是停滯于精子形成周期的13期。
　　4.隨著單劑量GHS-R1α的拮

6、抗劑[D-Lys-3]-GHRP-6注射時間的延長,ob/ob小鼠血清睪酮及促黃體生成素濃度逐漸升高,RT-qPCR顯示睪丸中雄激素生成限速酶的升高趨勢與睪酮升高趨勢一致。
　　5.TUNEL染色提示:[D-Lys-3]-GHRP-6處理后,注射各時間點ob/ob小鼠睪丸生精小管中凋亡的生精細(xì)胞數(shù)目的百分比分別下降了47.6%,76.3%和91.2%,各處理組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較對照組相比顯著減少(P<0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡

7、顯示凋亡蛋白bax表達(dá)逐漸減少而抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)逐漸增多。
　　6.PAS染色和HE染色顯示,隨著[D-Lys-3]-GHRP-6處理時間的延長,ob/ob小鼠生精阻滯小管數(shù)目逐漸減少,生精周期逐步恢復(fù)正常。
　　結(jié)論：
　　1.Ghrelin及其受體GHS-R1α在ob/ob小鼠睪丸中表達(dá)水平異常升高。
　　2.系統(tǒng)性抑制ghrelin/GHS-R1α信號通路可以促使ob/ob小鼠睪丸雄激素分泌增多,抑