1、喉癌是頭頸外科常見的惡性腫瘤，主要的病理類型為鱗狀細胞癌。主要危險因素包括吸煙，酗酒以及人乳頭狀瘤病毒感染等。近年研究報道幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染可能與喉癌相關，是喉癌的危險因素，但具體機制還需進一步深入研究。H.pylori是作為獨立致病因子還是與其它菌群共同作用而致病尚不清楚。人類微生物組學(Human microbiome)認為人體各解剖部位的菌群，作為一個有機群體通過許多復雜的機

2、制相互協(xié)調(diào)，共同作用，參與維持微環(huán)境的動態(tài)平衡。如果微環(huán)境菌群結構失代償，菌群紊亂，則可能導致疾病的產(chǎn)生。
　　本研究通過三個層面分析喉黏膜部位的微生物與喉鱗癌的關系:檢測H.pylori是否存在于喉黏膜，分析是否為喉鱗癌的危險因素;分析MSH2與MLH1基因在喉鱗癌中的表達水平，探討H.pylori是否誘導MSH2與MLH1表達改變而參與介導喉癌的發(fā)生;分析喉黏膜部位微生物的生態(tài)結構及其與喉鱗癌的動態(tài)差異性。
　　第一部分

3、，H.pylori與喉鱗癌的相關性研究。
　　分析H.pylori是否定植于喉黏膜，是否與喉鱗癌存在相關性。采用病例對照研究，分析81例喉鱗癌患者和75例對照人群（聲帶息肉和會厭囊腫）的H.pylori感染情況。應用巢式聚合酶鏈反應(Nested polymerase chain reaction,nPCR)聯(lián)合DNA測序，檢測兩組人群喉部H.pylori感染情況。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunoso

4、rbent assay，ELISA)檢測血清H.pylori的IgG抗體。通過nPCR檢測，結果顯示H.pylori存在于喉黏膜，喉鱗癌人群陽性率(71.6％)顯著高于對照組人群(28.4％)，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。腫瘤患者癌旁組織H.pylori陽性率高于腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)。應用Logistic回歸模型排除混雜因素，結果表明H.pylori是喉癌的危險因素[OR=8.12，95％置信區(qū)間:(3.

5、07，21.53)，p＜0.001]。但通過ELISA檢測，結果顯示兩組人群的差異沒有統(tǒng)計學意義(77.8％ vs.76.0％，p=0.79)。本部分研究通過nPCR發(fā)現(xiàn)H.pylori定植于喉黏膜，H.pylori感染與喉鱗癌存在相關性。推測該菌可能是喉癌的危險因素，喉黏膜可能是H.pylori的貯存部位和傳播的途徑之一。
　　第二部分，H.pylori誘導MSH2與MLH1基因表達改變在喉鱗癌中的機制研究。
　　分析MS

6、H2與MLH1在喉癌中的表達水平以及與生存函數(shù)的關系，探討定植于喉部的H.pylori是否誘導MSH2與MLH1的表達改變。收集兩組人群的組織樣本與病例資料。采用Real time PCR和Western blotting檢測第一組人群，21例喉鱗癌患者的MSH2與MLH1的mRNA與蛋白的表達水平?；仡櫺苑治龅诙M人群180例喉鱗癌患者的的生存函數(shù)，同時采用組織芯片技術(Tissue microarray，TMA)聯(lián)合免疫組化分析MS

7、H2與MLH1表達水平。建立感染模型，研究H.pylori是否誘導MSH2與MLH1的表達改變。結果顯示第一組人群的MSH2與MLH1的表達水平在腫瘤組織低于癌旁正常組織(p＜0.001)?；仡櫺苑治龅诙M喉癌患者的生存函數(shù)，結果表明MSH2與MLH1的表達水平與生存率相關，表達陰性患者生存時間低于陽性患者(MSH2:HR=4.38，95％置信區(qū)間:1.05-18.25; p=0.04;MLH1: HR=3.0，95％置信區(qū)間:1.76

8、-5.14;p＜0.001)。采用H.pylori標準菌株干擾喉癌細胞株HEp-2和AMC-HN-8，檢測在不同細菌干擾量及不同時間點的MSH2與MLH1的表達水平，結果顯示H.pylori可以明顯降低MSH2與MLH1的表達水平(p＜0.05)。本部分研究揭示了喉鱗癌患者的腫瘤組織中MSH2與MLH1表達水平下調(diào)，表達陰性的喉鱗癌患者的生存時間降低。推測定植于喉部的H.pylori可能誘導MSH2與MLH1的表達降低而參與喉癌的發(fā)生。

9、
　　第三部分，喉黏膜微生物的生態(tài)結構及其與喉鱗癌的動態(tài)差異性的研究。
　　分析喉黏膜部位微生物菌群整體的結構特征，以及正常人群與喉鱗癌患者的菌群結構的差異性。收集40例喉鱗癌患者與31例聲帶息肉的拭子樣本，同時收集對應的組織樣本。采用454 Genome Sequencer FLX Titanium platform高通量測序，共檢測到14個門218個屬的菌群。正常人群中，喉部主要的菌群在門水平主要包括:Firmicute

10、s門(59.0％)，Proteobacteria門(10.8％)，Bacteroidetes門(10.4％),Fusobacteria門(10.1％),Actinobacteria門(10.0％)。喉鱗癌患者中，在門水平主要的菌群為:Firmicutes門(52.5％)，F(xiàn)usobacteria門(16.2％),Bacteroidetes門(16.5％),Proteobacteria門(11.0％),Actinobacteria門(5.

11、5％)。結果顯示會厭附近與喉部聲門上至聲門下的菌群結構存在明顯差異性(p＜0.001)。喉鱗癌患者的菌群結構和正常人群的分布存在明顯的差異性(p=0.006)，部分微生物可能與喉鱗癌存在相關性(p＜0.05)。本部分研究首次揭示了喉黏膜菌群的生態(tài)結構，推測Peptostreptococcus屬，Prevotella屬， Parvimonas屬，Streptococcus屬，Granulicatella屬和螺桿菌屬等部分菌群是喉癌的危險因