1、研究表明惡性腫瘤生長(zhǎng)迅速的一個(gè)重要機(jī)制是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的同時(shí)，自身也可分泌多種抑制免疫活性的物質(zhì)，如白介素-6、白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，抑制免疫細(xì)胞的應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。因此，利用細(xì)胞因子優(yōu)化腫瘤抗原提呈的微環(huán)境，解除腫瘤細(xì)胞對(duì)其周圍免疫細(xì)胞的抑制作用，活化免疫細(xì)胞的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，是抑制腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視的一個(gè)重要措施。 白介素-10(IL-

2、10)被普遍認(rèn)為是一種免疫抑制性細(xì)胞因子，促使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，但近年對(duì)腫瘤免疫的研究方向部分傾向于IL-10的免疫刺激功能。實(shí)際上，在不同的腫瘤模型中，IL-10對(duì)天然性、適應(yīng)性免疫具有正反雙重調(diào)節(jié)作用，它能使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)，亦可作為一種免疫佐劑增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。有研究發(fā)現(xiàn)將IL-10基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞中，局部高表達(dá)的IL-10使腫瘤細(xì)胞喪失成瘤性并增強(qiáng)免疫原性，從而有效地激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，如IL-

3、10基因修飾的腫瘤細(xì)胞建造的動(dòng)物模型，黑色素瘤、CT26結(jié)腸癌、乳腺腫瘤、Burkitt淋巴瘤等的致瘤性降低，抑制程度與IL-10的分泌量呈正相關(guān)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力喪失，并最終引起腫瘤消除。 EG7是來(lái)源于C57BL／6的T淋巴瘤細(xì)胞EL-4穩(wěn)定表達(dá)OVA的腫瘤細(xì)胞株，將mIL-10基因轉(zhuǎn)染EG7細(xì)胞制備成穩(wěn)定表達(dá)IL-10的EG7／IL-10細(xì)胞株。C57BL／6小鼠皮下接種EG7／IL-10細(xì)胞，建立小鼠T淋巴瘤模型，使小鼠T淋

4、巴瘤局部微環(huán)境高表達(dá)IL-10，觀察小鼠體內(nèi)成瘤情況以及荷瘤小鼠的免疫功能，在先前對(duì)IL-10基因修飾腫瘤細(xì)胞研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討IL-10抗腫瘤機(jī)制，尤其是非特異性增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性。單獨(dú)應(yīng)用一些具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子如IL-10、IL-12、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等進(jìn)行基因治療雖然能有效地誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)，但它們的效果比較局限，一般只能在一定程度上局部抑制腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)于已經(jīng)惡性生長(zhǎng)的腫瘤，這種單獨(dú)細(xì)胞因子基因療

5、法很難達(dá)到理想的效果。選擇相互間有協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用的細(xì)胞因子，進(jìn)行聯(lián)合基因治療，是腫瘤細(xì)胞因子基因治療的一個(gè)發(fā)展方向。 實(shí)驗(yàn)表明，淋巴細(xì)胞趨化因子(Lptn)可特異性趨化自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)和T細(xì)胞至腫瘤發(fā)生部位，殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)。Dilloo等報(bào)道在小鼠腫瘤模型中，Lptn與IL-2聯(lián)合具有抗腫瘤活性，Lptn可吸引腫瘤局部的T細(xì)胞、NK細(xì)胞浸潤(rùn)，而IL-2使T細(xì)胞

6、大量擴(kuò)增。從而提高特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。以樹(shù)突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗，可通過(guò)提高樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈能力激發(fā)起抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTE)反應(yīng)。 鑒于Lptn可有效趨化NK和T細(xì)胞，我們將聯(lián)合Ad-Lptn瘤內(nèi)注射治療轉(zhuǎn)染IL-10的EG7 T淋巴瘤。本課題主要目的是研究IL-10基因修飾的EG7 T淋巴瘤的致瘤性及對(duì)荷瘤小鼠免疫功能影響，同時(shí)通過(guò)瘤內(nèi)注射Ad-Lptn聯(lián)合治療小鼠T淋巴瘤，觀察其對(duì)小鼠T淋巴瘤的治療作用以及

7、長(zhǎng)期免疫保護(hù)作用，為抗腫瘤治療新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。建立了穩(wěn)定表達(dá)IL-10的小鼠T淋巴瘤模型EG7，對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)、生存期做了進(jìn)一步觀察，應(yīng)用Lptn的重組腺病毒進(jìn)行瘤內(nèi)注射觀察其治療效果。 第一部分：IL-10基因修飾對(duì)EG7致瘤性的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EG7、EG7／IL-10細(xì)胞，注射至C57BL／6小鼠右大腿外側(cè)，建立T淋巴瘤模型，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小并觀察荷瘤小鼠的生存期，詳細(xì)記錄小鼠腫瘤生長(zhǎng)大小、速度及健

8、康狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與EG7對(duì)照組相比，IL-10基因修飾的EG7抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的IL-10增強(qiáng)了小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性并誘導(dǎo)了更多的Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)的分泌。提示機(jī)體被有效誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 第二部分：Ad—Lptn瘤內(nèi)注射增強(qiáng)IL-10基因修飾的EG7的抗腫瘤作用 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EG7、EG7／IL-10細(xì)胞，注射至

9、C57BL/6小鼠右大腿外側(cè)，建立T淋巴瘤模型，隨機(jī)分組后，分別瘤內(nèi)注射腺病毒Ad-Lptn進(jìn)行治療，并設(shè)PBS和Ad-lacZ為對(duì)照組，并測(cè)量腫瘤大小及觀察荷瘤小鼠的生存期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與EG7對(duì)照組相比，IL-10基因修飾的EG7致瘤性降低，腫瘤生長(zhǎng)緩慢；與PBS和Ad-LacZ對(duì)照組相比，聯(lián)合Ad-Lptn進(jìn)行治療，不僅顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而且促進(jìn)了腫瘤的消退，延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期，尤其是IL-10基因修飾的腫瘤。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，

10、瘤內(nèi)高表達(dá)的IL-10增強(qiáng)了小鼠的NK和CTL殺傷活性，提示機(jī)體被有效誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)；聯(lián)合Ad-Lptn治療更顯著增強(qiáng)了小鼠的NK和CTL殺傷活性并誘導(dǎo)了更多的Fh1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)的分泌。 進(jìn)一步用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了腫瘤組織中IP-10、Mig、VEGF和MMP-2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IP-10和Mig可表達(dá)在轉(zhuǎn)染IL-10的腫瘤組織和Ad-Lptn瘤內(nèi)治療組，而未轉(zhuǎn)

11、染IL-10的EG7組及其PBS、Ad-Lacz治療組則無(wú)表達(dá)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和間質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在轉(zhuǎn)染IL-10的腫瘤組織和Ad-Lptn瘤內(nèi)治療組的表達(dá)量較低，而未轉(zhuǎn)染IL-10的EG7組及其PBS、Ad-Lacz治療組則高表達(dá)。提示腫瘤微環(huán)境中IL-10和Lptn可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤組織表達(dá)更多的干擾素誘導(dǎo)蛋-10(IP-10)和干擾素誘導(dǎo)單核因子(Mig)，減少VEGF和MMP-2的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑制腫

12、瘤血管形成的抗腫瘤作用。 腫瘤組織“VEGF免疫組化和HE染色的結(jié)果與上述結(jié)論一致，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高表達(dá)IL-10組和Ad-Lptn治療組瘤內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)降低，瘤組織壞死明顯。提示腫瘤微環(huán)境中IL-10和Lptn可能抑制了腫瘤血管生成，致使腫瘤組織缺血壞死，壞死的腫瘤組織更有利于機(jī)體對(duì)腫瘤的清除。 第三部分：CD4+ T、CD8+ T、NK細(xì)胞亞群剔除實(shí)驗(yàn) EG7T淋巴瘤生長(zhǎng)迅速，惡性程度高，短時(shí)間

13、內(nèi)就能導(dǎo)致荷瘤小鼠死亡。通過(guò)腹腔注射抗CD4、抗CD8或抗NK1.1單克隆抗體，分別剔除CD4+ T、CD8+ T或NK細(xì)胞，并設(shè)大鼠IgG為陰性對(duì)照組。剔除效率經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果表明在小鼠外周血和脾臟中>95％的CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞被成功剔除。在各種免疫細(xì)胞亞群剔除的C57BL／6小鼠中，觀察了Ad-Lptn對(duì)EG7及IL-10基因轉(zhuǎn)染的EG7 T淋巴瘤的治療效果。結(jié)果表明CD4+T、CD8+T及NK細(xì)胞在Ad-Lpt

14、n和／或IL-10抗腫瘤效應(yīng)中均發(fā)揮了重要的作用，其中以CD8+T為主。 結(jié)論： 1.與EG7相比，IL-10基因修飾的EG7 T淋巴瘤生長(zhǎng)緩慢，腫塊較小，其機(jī)制與IL-10增強(qiáng)了荷瘤小鼠NK、CTL殺傷活性、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答相關(guān)。 2.接受Ad-Lptn瘤內(nèi)注射治療的荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢，腫塊較小，機(jī)制為L(zhǎng)ptn更進(jìn)一步增強(qiáng)了小鼠的NK和CTL殺傷活性，并誘導(dǎo)了更多的Th1型細(xì)胞因