1、研究背景：
　　 在缺血基礎上恢復血流后組織損傷加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現象稱為缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)。現已證實,心、腦、肝、腎、肺、胃腸道、肢體及皮膚等多種組織器官都存在缺血再灌注損傷的現象。心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/repeifusion injury,MIRI)為再灌注后缺血的心肌出現舒縮功能降低、心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結構的

2、變化和血管無復流等現象。缺血再灌注損傷的發(fā)生機制尚未徹底闡明,既往研究證實氧自由基(oxygen free radical,OFR)的作用、白細胞激活、內皮細胞(endothelial cell,EC)功能障礙、細胞內鈣超載以及細胞凋亡是引起缺血一再灌注損傷的重要原因。
　　 糖尿病(diabetes mellitus,DM)是常見病、多發(fā)病,現已明確DM是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病的一個重要因素。流行病學資料顯示:DM人群中

3、心絞痛、急性心肌梗死(acrue myocardial inarction,AMI)、充血性心力衰竭以及嚴重心律失常等疾病發(fā)病率遠高于非DM患者,而且當DM患者并發(fā)心肌梗死后行藥物或手術(包括冠狀動脈搭橋和導管介入)治療,效果均不及非DM患者。人們將這種不良后果歸咎于缺血再灌注(ischemia/repeifusion,I/R),這可能與糖尿病患者冠狀動脈粥樣病變嚴重而彌漫、內皮功能障礙、儲備能力降低所造成的心肌灌注不良有關,另外DM本

4、身的促凝和炎癥狀態(tài),易形成冠狀動脈內微血栓堵塞；DM心肌缺氧應激,NO活性降低,存在冠脈微循環(huán)痙攣。而日本的一項多中心研究卻顯示:急診經皮冠狀動脈介入治療(pereultaneous coronaryintervention,PCI)住院期間患者病死率與是否患有DM無關,而與血糖增高有關,且發(fā)現無DM但伴有高血糖者的死亡率最高,該研究推測這可能與DM性冠心病梗死相關血管(infarct-related artery,IRA)再通后I/R

5、損傷增加有關。
　　 基礎研究顯示DM發(fā)生時,心肌組織的結構、功能以及代謝均發(fā)生異常,主要表現為:①心肌能量代謝異常,且高糖環(huán)境能夠直接引起正常心肌細胞功能改變；②細胞內鈣調控異常；③微血管病變和微循環(huán)障礙,緩激肽釋放酶一緩激肽系統(tǒng)在高血糖狀態(tài)下該系統(tǒng)被抑制；④高血糖時氧化應激增加,信號轉導途徑改變,激活細胞凋亡。國內外研究證實,DM急性期,NO代償性合成增加,I/R對DM心肌有保護作用；而DM晚期,由于慢性期NO減少,心肌肥厚

6、,收縮和舒張功能受損,心臟血管周圍或間質纖維化,I/R后損傷后將加重心肌損害。
　　 近來,心肌缺血再灌注損傷和心肌保護一直是基礎研究和臨床研究的重點。1986年Murry等首次提出缺血預處理(Ischemia preconditioning,IPC)可以減輕缺血再灌注所致的心肌損傷,隨后的一系列研究則發(fā)現許多麻醉藥物(包括全身麻醉藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥以及局部麻醉藥)預處理能產生與經典缺血預處理同樣的心肌保護作用,這為預處理心肌保護

7、的臨床應用開辟了新的途徑。利多卡因在急性心梗、惡性心律失常等引起的IR損傷治療中具有較好的效果。有關預防性應用利多卡因的臨床有效性和安全性一直備受爭議。既往的薈萃分析(meta-analysis)表明預防性應用利多卡因雖然可減少急性心肌梗死患者心室纖顫的發(fā)生,但卻增加了患者的死亡率。然而,一項多國家多中心觀察研究表明:預防性應用利多卡因并不增加急性心肌梗死患者的死亡率,預防性應用利多卡因也許是無害的?？偠灾?關于利多卡因預處理在心肌缺

8、血再灌注損傷防治中的作用目前尚不明了,更不能確定利多卡因預處理心肌保護效應的具體作用機制。
　　 目的：
　　 本研究通過在體外細胞水平以缺氧復氧處理H9c2大鼠成肌細胞建立心肌缺血再灌注損傷模型,初步探討:①不同梯度濃度利多卡因預處理對缺氧復氧引起的心肌細胞損傷是否具有保護作用；②利多卡因預處理對缺氧復氧引起的H9c2心肌細胞凋亡的影響及其可能機制。③利多卡因預處理對高糖孵育下H9c2心肌細胞缺氧復氧損傷是否具有保護作

9、用及與高糖孵育的關系。
　　 方法
　　 第一部分:研究不同濃度利多卡因預處理對H9c2大鼠成肌細胞缺氧復氧損傷的影響。實驗隨機分為7組:正常對照組(NC組)、缺氧復氧損傷對照組(腿組)；利多卡因預處理組(LP組),根據利多卡因的不同濃度對分為LP1(1μmol/L)、LP2(2.51μmol/L)、LP3(5μmol/L)、LP4(10μmol/L)、LP5(20μmol/L)組,每組6孔。心肌細胞損傷程度以心肌細胞活

10、力和乳酸脫氫酶(LDH)活性來表示,同時檢測心肌細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
　　 第二部分:研究利多卡因預處理對H9c2大鼠成肌細胞缺氧復氧損傷后caspase-3活性、鈣超載的影響。實驗隨機分為3組:①正常對照組(NC組)；②缺氧復氧組(H/R組)；③利多卡因預處理組(LPC組)。心肌細胞損傷程度以心肌細胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)活性來表示。用流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率。通過免疫細胞化學技術檢

11、測心肌細胞胞漿caspase-3的表達。熒光分光光度法檢測細胞內鈣離子濃度。
　　 第三部分:研究利多卡因預處理對高糖孵育下H9c2心肌細胞缺氧復氧性損傷是否具有保護作用。實驗隨機分為二組,即正常糖濃度組(N組)和高糖濃度組(H組),每組又分為正常對照組(NC組和HC組)、缺氧復氧損傷組(NHR組和HHR組)和利多卡因預處理組(NLP組和HLP組)。心肌細胞損傷程度以H9c2細胞活力和培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)釋放量來表示,同

12、時檢測H9c2細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
　　 結果
　　 第一部分:與NC組比較,HR組細胞活力顯著減弱,LDH釋放量顯著增加,并且MDA含量增多,SOD活性降低；與HR組比較,L2～5組細胞活力顯著增強,LDH釋放量顯著降低；并且MDA含量下降,SOD活性增強；且Pearson積差相關分析顯示,細胞活力強弱的變化與LDH釋放量(r=-0.870,P=0.000)、MDA含量(r=-0.9

13、24,P=0.000)呈負相關,與SOD活性呈正相關(r=0.894,P=0.000)。細胞活力的增強與利多卡因濃度的增加呈正相關(r=0.976,P=0.001),與LDH釋放量(r=-0.912,P=0.011)和MDA含量(r=-0.969,P=0.001)呈負相關。
　　 第二部分:與NC組比較,缺氧復氧處理細胞后可使其LDH釋放量顯著增高(P<0.01),細胞活力明顯下降(P<0.01),流式細胞儀檢測到大量心肌細胞凋

14、亡,凋亡率為20.12±1:2.19％。利多卡因預處理細胞可顯著提高心肌細胞活力(P<0.01),降低LDH釋放量和細胞凋亡率(P<0.01)。免疫細胞化學技術檢測結果表明,缺氧復氧損傷后心肌細胞中caspase-3活性增強；而利多卡因預處理則可降低caspase-3活性。熒光風光度法檢測顯示,缺氧復氧損傷后細胞內鈣離子濃度顯著升高；而利多卡因預處理則可降低細胞內鈣離子濃度。
　　 第三部分:①N組:缺氧復氧后細胞LDH釋放量、

15、MDA含量較NC組顯著增多,細胞活力、SOD活性顯著減弱。缺氧前利多卡因預處理細胞后,其細胞MDA含量較NHR組顯著減少,SOD活性顯著增強(P均<0.01)；②H組:缺氧復氧后,與HC組比較,其LDH釋放量、MDA含量顯著增多,而細胞活力、SOD活性顯著降低；而利多卡因預處理細胞后,與HHR組比較,其LDH釋放量、MDA含量顯著減少,細胞活力、SOD活性顯著增高(P均<0.01)。③與N組比較:高糖孵育心肌細胞后其LDH釋放量、MDA

16、含量較NC組顯著增多,而細胞活力、SOD活性則顯著降低(P均<0.01)。④高糖與實驗處理(分組)兩因素的交互效應均具有顯著統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。
　　 結論
　　 (1)本研究濃度范圍內的利多卡因能減輕心肌細胞的缺氧復氧損傷,并呈濃度依賴性:其機制可能與利多卡因的抗自由基作用、離子通道阻滯功能以及抗凋亡作用有關。
　　 (2)缺氧前給予濃度為10μmol/L的利多卡因能夠增強H9c2心肌細胞耐受缺氧復氧