1、第一部分殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠圓窗龕局部給藥治療梅尼埃病的有效性及安全性研究
　　 研究目的:
　　 目前利用慶大霉素(GT)耳毒性，治療梅尼埃病眩暈，得到越來越多的耳科醫(yī)生的關注。慶大霉素內耳局部給藥用于治療梅尼埃病，操作簡單，療效確切。由于給藥濃度及劑量的不同，不同研究表明，慶大霉素除了發(fā)揮對前庭毛細胞的破壞作用外，其對內耳毛細胞亦有不同程度的損傷。該研究應用殼聚糖-磷酸甘油(CGP)凝膠攜帶慶大霉素，通過圓

2、窗龕給藥的方式，可控及緩釋地將慶大霉素釋放進入內耳，與傳統(tǒng)鼓室內注射慶大霉素相比，評估其治療梅尼埃病的安全性及有效性。
　　 實驗方法:
　　 聽力及前庭功能正常的C57BL/6J小鼠（6-8周）24只，隨機分成3組，A組為經鼓膜穿刺隔日注射慶大霉素硫酸鹽(6mg/ml，10ul)組;B組為經鼓膜穿刺隔2日注射慶大霉素硫酸鹽(6mg/ml，l0ul)組;C組為應用CGP凝膠緩釋系統(tǒng)經圓窗龕釋放慶大霉素(300mg/ml，

3、0.2ul)組。A、B組小鼠均接受2周重復藥物注射，C組小鼠僅接受1次圓窗龕給藥。聽力學評估:在注射前及注射后14天，采應用腦干誘發(fā)電位(ABR)評估小鼠的聽力變化情況;前庭功能評估:在注射前及注射后的14天內，每天進行垂直轉鼓實驗，評估小鼠的前庭功能變化情況。
　　 實驗結果:
　　 ABR檢測示:在注射后的第14天，A組小鼠ABR閾值在16kHz、24kHz、32kHz、40kHz均比用藥前明顯提高，差異有顯著統(tǒng)計學

4、意義(p＜0.05);B組小鼠在注射后第14天，僅有40kHzABR閾值較注射前顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(p=0.030，p＜0.05)，其余頻率，ABR閾值均未見明顯提高，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);C組小鼠各頻率ABR閾值較注射前均無顯著提高，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 垂直轉鼓實驗示:A組小鼠在術后第10天的保持時間比術前明顯降低(p=0.031，p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，而在術后第14天的保

5、持時間與術前相比無明顯差異(p=0.105，p＞0.05)，無統(tǒng)計學意義;B組小鼠在術后所有時間點均與術前數(shù)據(jù)無顯著性差異(p＞0.05);C組小鼠的平均保持時間在術后第6天、第10天與術后第14天均明顯低于術前（p值分別為0.041，0.034，0.006;p值均＜0.05）。C組小鼠的平均保持時間在術后14天明顯低于A組(p=0.019;p＜0.05)和B組(p=0.016;p＜0.05)。
　　 實驗結論:
　　

6、殼聚糖-磷酸甘油(CGP)凝膠緩釋系統(tǒng)攜帶慶大霉素進入內耳，可以造成持續(xù)而穩(wěn)定的前庭功能下降，而不引起顯著的聽覺功能下降，較之傳統(tǒng)的鼓室注射治療，其是一種安全而有效的內耳緩釋給藥系統(tǒng)，有良好的臨床應用前景。
　　 第二部分
　　 殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠經圓窗龕給藥后慶大霉素在內耳毛細胞的分布
　　 研究目的:
　　 目前利用慶大霉素耳毒性，治療梅尼埃病眩暈，得到越來越多的耳科醫(yī)生的關注。慶大霉素內

7、耳局部給藥用于治療梅尼埃病，操作簡單，療效確切。但是由于直接注射慶大霉素至中耳后，不能準確地控制與圓窗膜接觸的藥量，而且部分藥液通過咽鼓管排除中耳腔，或被中耳腔粘膜吸收，因此導致進入內耳的慶大霉素的劑量有很大波動性，因此也產生了很大的療效差異。為克服現(xiàn)有方法的局限，建立一種安全有效并且方便的給藥模式，使其能夠在單次應用后，即可持續(xù)緩慢地釋放慶大霉素至內耳，我們建立了殼聚糖-磷酸甘油凝膠系統(tǒng)應用于慶大霉素內耳局部給藥。前期研究通過與傳統(tǒng)鼓

8、室內注射的對照，已經證明殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠在小鼠圓窗龕局部注射后，緩釋慶大霉素至內耳的能力，及其對耳蝸、前庭系統(tǒng)功能的影響。但是對于此緩釋凝膠攜帶慶大霉素進入內耳后，慶大霉素在內耳的分布情況，我們尚不清楚，因此，此實驗的目的是研究慶大霉素在該緩釋凝膠系統(tǒng)的緩釋作用下，在內耳毛細胞中如何分布的，以及如何影響內耳毛細胞的形態(tài)及功能的。
　　 實驗方法:
　　 將硫酸慶大霉素(gentamicin，GT)和德州紅(

9、texasred，TR)混合后置于37°攪拌過夜使其結合形成慶大霉素德州紅螯合物(gentamicin-texasred，GTTR)，然后將GTTR與殼聚糖-磷酸甘油凝膠(CGP)混合形成殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠(CGP-GTTR-hydrogel)。通過耳后入路暴露小鼠左側耳蝸圓窗龕，取0.5ul該凝膠注入圓窗龕內，讓其左耳向上平臥半小時待膠體凝固。分別于凝膠注射后1天及7天，采取心臟灌注4％多聚甲醛的方式處死小鼠，快速將其耳蝸

10、取下，蝸內灌注固定液，固定2小時后，解剖其基底膜、橢圓囊斑及球囊斑，用Phalloidin-Alexa-488進行染色，進行鋪片，使用Leica激光共聚焦顯微鏡觀察分析，Phalloidin與GTTR使用紅綠雙色熒光通道進行掃描觀察，選擇一定的區(qū)域進行熒光半定量分析，測定得到的平均像素強度即為熒光強度。觀察慶大霉素在內耳的分布規(guī)律及毛細胞的形態(tài)。
　　 實驗結果:
　　 在前庭系統(tǒng)中，經圓窗龕局部注射殼聚糖-磷酸甘油-慶

11、大霉素凝膠1天后，紅色顆粒狀GTTR熒光主要位于球囊斑上的毛細胞胞質內，其熒光強度在注射后1天和7天分別是14.13±4.09，4.69±1.76，注射后7天時的熒光強度明顯強于注射后1天時的熒光強度，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。另外，注射后1天時表皮板表面的纖毛束明顯多于注射后7天時的纖毛束。
　　 在耳蝸系統(tǒng)中，經圓窗龕局部注射殼聚糖-磷酸甘油-慶大霉素凝膠1天后，可觀察到紅色顆粒狀GTTR熒光主要位于耳蝸基底膜的底轉

12、及中轉，其熒光強度分別為51.59±6.42，20.64±4.14，底轉強度明顯強于中轉熒光強度(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。同樣地，在注射凝膠7天后，紅色顆粒狀GTTR熒光仍然位于耳蝸基底膜的底轉及中轉，其熒光強度分別為43.01±3.61，12.17±2.43，底轉強度明顯強于中轉熒光強度(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。在凝膠注射后的1天和7天，耳蝸的頂轉均未見到紅色顆粒狀熒光。同時，比較耳蝸底轉在注射后1天和7天的熒光強

13、度可見，注射后1天的熒光強度明顯強于注射后7天，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;同樣比較耳蝸中轉在注射后1天和7天的熒光強度發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律，注射后1天的熒光強度明顯強于注射后7天，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。另外，在注射后7天，耳蝸底轉部分外毛細胞缺失，但是在注射后1天和7天，在耳蝸的頂轉及中轉均未見毛細胞的缺失。
　　 研究結論:
　　 該研究探討了慶大霉素通過該凝膠緩釋系統(tǒng)釋放進入內耳后，慶大霉素在內耳的分布