1、目的：腦缺血性疾病是嚴(yán)重危害公眾健康的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率和病死率之高以及目前治療藥物的局限性，已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，因而尋找新的腦缺血性疾病防治藥物的靶點(diǎn)藉此開發(fā)理想的藥物成為目前人們關(guān)注的重要課題。目前研究發(fā)現(xiàn)ATP敏感鉀通道(KATP)不僅可以減輕心肌缺血再灌注損傷，在腦缺血損傷中也發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，KATP有望成為防治腦缺血損傷的新靶點(diǎn)。KATP包括細(xì)胞膜ATP敏感鉀通道(sKARP)和線粒體ATP敏感鉀通道(m

2、itoKATP)，KATP由內(nèi)向整流鉀通道(Kir)和硫脲類受體(SUR)兩部分組成，前者形成離子通道，后者決定著KATP的功能。研究發(fā)現(xiàn)Kir6.1 mRNA和SUR mRNA在嚙齒類動(dòng)物腦中均有表達(dá)。在腦缺血缺氧再灌注損傷過程中，不同KATP開放劑和阻斷劑預(yù)處理對(duì)于鉀通道亞基是否有影響；KATP開放劑預(yù)處理能否保護(hù)神經(jīng)元，以及不同KATP開放劑的保護(hù)作用是否有差別還需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用mitoKATP開放劑(二氮嗪)、mito

3、KATP阻斷劑(5-羥葵酸)、非選擇性KATP開放劑(吡那地爾)以及非選擇性KATP阻斷劑(格列本脲)分別對(duì)沙鼠進(jìn)行預(yù)處理，觀察其對(duì)缺血再灌注后腦組織形態(tài)學(xué)的影響及對(duì)腦組織中KATP kir6.1、SUR1、SUR2三個(gè)亞基表達(dá)的影響；采用KATP調(diào)節(jié)劑預(yù)處理海馬神經(jīng)元，觀察缺氧再灌注后海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、存活率、凋亡率及培養(yǎng)基中LDH含量等方面的影響。
　　 方法：
　　 1.采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立沙鼠缺血再灌注(I-

4、R)模型，將48只沙鼠隨機(jī)分成8組：假手術(shù)組，I-R組，I-R+二氮嗪組，I-R+5-羥葵酸(5-HD)組，I-R+二氮嗪+5-HD組，I-R+吡那地爾組，I-R+格列本脲組，I-R+吡那地爾+格列本脲組。分別給予相應(yīng)KATP開放劑與阻斷劑，部分腦組織制作病理切片進(jìn)行HE染色，部分提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交(Western Blot)，觀察藥物預(yù)處理對(duì)腦組織形態(tài)學(xué)的影響，對(duì)KATP

5、亞基mRNA及Kir6.1蛋白表達(dá)的影響。
　　 2.取新生24hr Wistar大鼠乳鼠分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，采用95％N2和5％CO2混合氣體制備缺氧再灌注(H-R)模型。將原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分成10組：正常對(duì)照(N)組，缺氧再灌注(H-R)組，H-R+二氮嗪(D)組，H-R+5-羥葵酸(5-HD)組，H-R+吡那地爾(P)組，H-R+格列本脲(G)組，H-R+D+5-HD組，H-R+D+G組，H-R+P+G組，H-R+

6、P+5-HD組。分別給予相應(yīng)KATP開放劑與阻斷劑，觀察各組海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變，用臺(tái)盼藍(lán)染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率及凋亡率，用Hoechs t33342染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，使用LDH試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH含量，觀察細(xì)胞的損傷程度。
　　 結(jié)果：
　　 1.KATP調(diào)節(jié)劑預(yù)處理對(duì)各組腦組織形態(tài)學(xué)及KATP亞基mRNA、蛋白表達(dá)的影響：
　　 ①HE染色：假手術(shù)對(duì)照組沙鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元形態(tài)正常

7、，胞漿、胞核清晰，細(xì)胞排列有序。與假手術(shù)對(duì)照組比較，I-R組及藥物預(yù)處理組神經(jīng)元均有不同程度神經(jīng)元腫脹，體積增大，形態(tài)變圓，胞漿嗜伊紅染色變淺，細(xì)胞排列紊亂；與I-R組比較，I-R+D組和I-R+P組神經(jīng)元病理改變較輕；與I-R+D組比較，I-R+D+5HD組神經(jīng)元著色不均，排列略顯雜亂，I-R+P組神經(jīng)元病理改變稍重；與I-R+P組比較，I-R+P+G組神經(jīng)元淡染，病理改變明顯。
　　 ②RT-PCR:缺血可代償增加Kir6.

8、1 mRNA的表達(dá)，選擇性mitoKATP開放劑二氮嗪可明顯增加Kir6.1 mRNA表達(dá)(P<0.01)，阻斷劑5-HD和格列本脲降低其表達(dá)，尤以后者最為明顯(P<0.01)。缺血、鉀通道開放劑和阻斷劑不影響SUR1mRNA在沙鼠腦內(nèi)的表達(dá)變化。缺血可增加SUR2mRNA的表達(dá)，但鉀通道開放劑和阻斷劑對(duì)其無明顯影響。
　　 ③Western Blot：缺血、鉀通道開放劑和阻斷劑不影響Kir6.1蛋白在沙鼠腦內(nèi)表達(dá)的變化。

9、>　　 2.KATP調(diào)節(jié)劑預(yù)處理對(duì)各組海馬神經(jīng)元存活率、凋亡率及LDH含量的影響：
　　 ①神經(jīng)元存活率：與N組(94.7±2.28)％比較，H-R組及藥物處理組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)；與H-R組(73.2±3.51)％比較，H-R+D組(85.2±4.71)％、H-R+P組(84.6±1.94)％存活率明顯增高(P<0.01)；與H-R+D組比較，H-R+D+5 HD組(75.6±3.14)％存活率明顯降低(P<

10、0.01)，H-R+P組存活率略降低I(P>0.05)，H-R+D+G組(68.2±5.11)％存活率明顯降低(P<0.01)；與H-R+D+5 HD組比較，H-R+D+G組存活率明顯降低(P<0.01)，H-R+P+5 HD組(74.3±6.08)％存活率降低(P<0.05)。
　　 ②神經(jīng)元凋亡率：與N組總凋亡率(12.40±0.07)％比較，H-R組總凋亡率及藥物預(yù)處理組凋亡率均明顯增高(P<0.01)；與H-R組(49.

11、51±2.58)％比較，H-R+D組凋亡率(23.82±0.14)％、H-R+P組凋亡率(37.05±0.67)％均明顯降低(P<0.01)；與H-R+D組比較，H-R+D+5 HD組凋亡率(34.81±0.83)％、H-R+P組凋亡率、H-R+D+G組凋亡率(50.48±0.56)％均明顯增加(P<0.01)：與H-R+D+5 HD組比較，H-R+D+G組凋亡率明顯增加(P<0.01)，H-R+P+5HD組凋亡率(35.65±0.49

12、)％略增加(P>0.05)。
　　 ③培養(yǎng)基中LDH含量：與N組(76.84±10.53) U/L比較，H-R組及藥物處理組LDH含量明顯增加(P<0.01)；與H-R組(255.45±26.23)U/L比較，H-R+D組LDH含量(133.29±15.00) U/L與H-R+P組LDH含量(193.47±3.39) U/L明顯降低(P<0.01)；與H-R+D組比較，H-R+D+5HD組LDH含量(302.90±16.61)

13、U/L、H-R+P組LDH含量、H-R+D+G組LDH含量(378.26±7.63)U/L均明顯增加(P<0.01)；與H-R+D+5 HD組比較，H-R+D+G組LDH含量明顯增加(P<0.01)，H-R+P+5HD組LDH含量(329.59±10.31) U/L增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.mitoKATP開放劑二氮嗪和非選擇性KATP開放劑吡那地爾預(yù)處理均能夠減輕整體沙鼠腦缺血缺氧再灌注的損傷作用

14、，且mitoKATP開放劑二氮嗪的保護(hù)作用優(yōu)于吡那地爾。
　　 2.在離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元缺氧再灌注損傷中，二氮嗪和吡那地爾均可增加神經(jīng)元的存活率，降低神經(jīng)元凋亡率及培養(yǎng)基中LDH含量，且二氮嗪在降低凋亡率和培養(yǎng)基中LDH含量方面的保護(hù)作用優(yōu)于吡那地爾。
　　 3.在腦缺血再灌注下，二氮嗪可明顯增加Kir6.1mRNA的表達(dá)，KATP開放劑和阻斷劑均不影響SUR1和SUR2mRNA的表達(dá)。提示mitoKATP(亞基為Kir