1、研究背景與目的:目前有實(shí)驗(yàn)研究表明Bcr是bcr/abl的負(fù)調(diào)控基因,其表達(dá)可以抑制P210bcr/abl蛋白功能,Bcr蛋白的第354氨基酸絲氨酸磷酸化是Bcr抑制bcr/abl活性的關(guān)鍵,另外,在Bcr基因部分,存在一個(gè)GRB2的SH2結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)的Tyr177磷酸化后,可以誘導(dǎo)Gab2磷酸化,進(jìn)而導(dǎo)致RAS通路的激活,參與了細(xì)胞的增殖.為了證實(shí)Bcr對(duì)bcr/abl的負(fù)調(diào)控作用機(jī)制,我們構(gòu)建了短片斷的Bcr基因的真核表達(dá)載體,

2、并包含Bcr蛋白的第354位氨基酸絲氨酸磷酸化位點(diǎn);以目的基因轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后,觀察目的基因?qū)562細(xì)胞增殖與凋亡的影響,是否具有Bcr全長基因的功能,如能獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,將為后續(xù)的Bcr基因和Bcr與bcr/abl基因相互作用打下基礎(chǔ),并驗(yàn)證我們?cè)岢龅睦碚摷僭O(shè)之一:bcr/abl在正常造血干細(xì)胞中表達(dá)、誘導(dǎo)Bcr表達(dá)或表達(dá)增高,通過Bcr表達(dá)或高表達(dá)誘導(dǎo)bcr/abl表達(dá)陽性的造血干細(xì)胞發(fā)生凋亡,揭示CML病程演進(jìn)中的分子

3、機(jī)理,同時(shí)為CML的分子靶治療提供理論依據(jù).方法:從健康人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞,采用PCR法克隆目的基因Bcr片斷,構(gòu)建在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的帶有Bcr基因綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pEGFP-Bcr系統(tǒng);采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)介導(dǎo)重組Bcr基因在k562細(xì)胞表達(dá);熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果和轉(zhuǎn)染率.G418篩選轉(zhuǎn)染的陽性克隆(轉(zhuǎn)染空載體PEGFP-N1的K562細(xì)胞命名為K562control,轉(zhuǎn)染PEGFP-Bc

4、r命名為K562eGFP-bcr);Western-Blot鑒定K562eGFP-bcr基因表達(dá)蛋白;MTT法測(cè)定K562control和K562eGFP-bcr細(xì)胞增殖能力.Annexin-V/PI雙染實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、Heoechst33258染色后及DNAladder方法檢測(cè)K562control和K562eGFP-bcr細(xì)胞凋亡情況.結(jié)論:該研究通過構(gòu)建帶有短片斷的Bcr功能基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染短片斷Bcr目的基