1、【目的】 膀胱腫瘤為泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，在我國其發(fā)病率在泌尿系腫瘤中居首位，且大多數(shù)膀胱癌表現(xiàn)為多中心性與復發(fā)率高的特點。目前臨床的治療手段主要是手術治療和術后化療，但復發(fā)率較高，而目前常用的化療藥物在使用一段時間后都出現(xiàn)不同程度耐藥性，且并發(fā)癥較多?？鼓[瘤化療的策略主要在于清除腫瘤細胞，盡管其作用機制各異，但化學藥物所致胞毒作用的終末效應均為誘導細胞凋亡，而腫瘤細胞對于藥物所致的抵抗性是腫瘤治療失敗的主要原因。通過調(diào)控凋亡信

2、號轉導途徑相關的胞內(nèi)調(diào)控因子，將有可能影響腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。因此，本研究以膀胱腫瘤細胞為研究對象，以重組腺相關病毒為載體，介導第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑(Smac/DIABLO)參與凋亡調(diào)控，研究膀胱癌細胞對普通化療藥物的抵抗性降低的過程，并從分子水平嘗試探討腫瘤細胞對化療藥物抵抗性降低的分子機制。 【方法】 應用細胞傳代培養(yǎng)技術培養(yǎng)獲得鼠膀胱腫瘤細胞(MBT-2)后，將轉染有第二個線粒體來源的胱氨酸酶激

3、活劑的重組腺相關病毒(rAAV-Smac/DIABLO)加入到培養(yǎng)液中轉染 MBT-2 細胞，RT-PCR 法測定 Smac/DIABLO在細胞中的表達情況，當?shù)鞍妆磉_穩(wěn)定后加入普通化療藥物絲裂霉素誘導凋亡啟動，運用四甲基偶氮唑藍還原反應(MTT法)測定MBT-2細胞增殖的抑制作用，對照比較轉染Smac/DIABLO前后化療藥物胞誘膀胱癌細導凋亡的差異。流式細胞儀測定不同加藥組對MBT-2膀胱癌細胞的凋亡的誘導情況，所得數(shù)據(jù)使用SAS9

4、.0統(tǒng)計軟件分析。 【結果】 1.rAAV-Smae/DIABLO轉染MBT-2腫瘤細胞后RT-PCR檢測Smac/DIABLO表達情況 rAAV-Smac/DIABLO 轉染 MBT-2 腫瘤細胞后，采用 RT-PCR 法檢測Smac/DIABLO 在細胞中的表達量，24小時后有條帶出現(xiàn)，48小時后穩(wěn)定表達。 2.rAAV-Smac轉染MBT-2后提高了化療藥物的抑制率 2.1 絲裂霉素對MBT

5、-2腫瘤細胞的抑制情況 MTT檢測顯示按照濃度梯度加入絲裂霉素，觀察對MBT-2腫瘤細胞均有不同程度抑制增殖作用，同空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0．01). 2.2 rAAV-Smac/DIABLO轉染MBT-2后化療藥物對腫瘤細胞的抑制情況 MTT檢測顯示轉染 rAAV-Smac/DIABLO后48小時聯(lián)合使用絲裂霉素對MBT-2 腫瘤細胞均有不同程度抑制增殖作用，同空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0．01

6、)。 2.3 對2.1和2.2數(shù)據(jù)進行2×5析因設計的方差分析 對2.1和2.2數(shù)據(jù)建立2×5的析因設計方差分析統(tǒng)計模型，計算各統(tǒng)計量結果顯示 rAAV-Smac/DIABLO 轉染因素使腫瘤細胞的抑制率有差別，轉染后腫瘤細胞抑制率更高，有統(tǒng)計學意義。(P<0.05) 3.rAAV-Smac轉染MBT-2后降低了腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性(本實驗組所用MMC均為0.05mg/ml低劑量誘導凋亡啟動) 3.

7、1 化療藥物采用低劑量時，rAAV-Smac/DIABLO+MMC組腫瘤細胞的抑制率最高 采用低濃度絲裂霉素誘導凋亡啟動，經(jīng)MTT檢測顯示各加藥組(空白組、MMC 組、Smac/DIABLO 組、Smac/DIABLO+MMC 組)中Smac組抑制率7.94±1.85；MMC組抑制率9.23±2.23；rAAV-Smac/DIABLO+MMC組抑制率28.38±3.84：rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組對腫瘤細胞的抑

8、制率高于其它組，差別有統(tǒng)計學意義。(P<0.01) 3.2 化療藥物采用低劑量時，rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組腫瘤細胞的凋亡率最高 采用低濃度絲裂霉素誘導凋亡啟動，經(jīng)流式細胞檢測顯示各加藥組(空白組、MMC組、Smac/DIABLO 組、Smac/DIABLO+MMC 組)中Smac 組凋亡率7.29±1.25；MMC組抑制率5.25±1.21；rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組抑制率22.18

9、±1.62；rAAV-Smac/DIABLO+MMC 組腫瘤細胞的凋亡率高于其它組，差別有統(tǒng)計學意義。(P<0.01)其中rAAV-Smac/DIABLO 聯(lián)合使用絲裂霉素對腫瘤細胞的促凋亡作用最高，二者具有協(xié)同效應，凋亡峰明顯。(P<0.01) 【結論】 1.rAAV-Smac/DIABLO 能夠有效的轉染 MBT-2 膀胱癌細胞，大約在轉染后48小時表達量達到治療水平，表達持續(xù)穩(wěn)定。 2.轉染了Smac/DI