1、目的：氨氯地平（Aml）是臨床上常用的二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。Aml分左旋、右旋和消旋Aml，但不同旋體Aml作用機(jī)理尚不清楚，本研究擬采用膜片技術(shù)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度熒光測(cè)定技術(shù)探討不同旋體Aml對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞靜息電位（RP）、動(dòng)作電位（AP）、離子流及心室肌和平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，從細(xì)胞、分子和離子水平研究不同旋體Aml的作用機(jī)理，為臨床準(zhǔn)確合理使用不同旋體Aml提供理論依據(jù)。 方法：（1

2、）采用“四步”酶消化法，即無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流、50μmol/L低鈣酶液灌流、200μmol/L低鈣臺(tái)氏液灌流和室溫下KB液中孵育。分離大鼠心室肌細(xì)胞后，記錄正常大鼠心室肌細(xì)胞RP、AP、鈉離子電流（INa）、L—型鈣離子電流（ICa—L）、瞬時(shí)外向鉀離子電流（Ito）、延遲整流性鉀離子電流（Ik）和內(nèi)向整流性鉀離子電流（Ik1）。分別加入0.1、0.5、1、5和10μmol/L左旋、右旋和消旋Aml，觀察不同濃度下不同旋體Aml對(duì)RP、AP

3、、INa、ICa—L、Ito、Ik和Ik1影響。 （2）酶消化法分離大鼠心室肌細(xì)胞后，采用熒光探針Fura—2/AM測(cè)定心室細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，然后分別加入1、5、10、50和100μmol/L左旋、右旋和消旋Aml，觀察不同濃度下不同旋體Aml對(duì)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 （3）采用“兩步”酶消化法，即先以酶液Ⅰ消化30分鐘左右，再以酶液Ⅱ消化15分鐘左右。分離大鼠胸腹主動(dòng)脈平滑肌后，使用熒光探針Fura—2/AM測(cè)

4、定平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，然后分別加入0.1、0.5、1、5和10μmol/L左旋、右旋和消旋Aml，觀察不同濃度下不同旋體Aml對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 結(jié)果：（1）大鼠心室肌細(xì)胞分離：在分離過(guò)程中如整個(gè)心臟保持紅潤(rùn)，則細(xì)胞數(shù)量在90%以上，KB液中孵育后耐鈣心肌細(xì)胞在70%左右；在分離過(guò)程中心臟局部保持紅潤(rùn)部位的細(xì)胞數(shù)量在80%以上，耐鈣細(xì)胞在60%左右，而蒼白區(qū)細(xì)胞數(shù)量變異較大，但一般均在50%以下，且耐鈣細(xì)胞較少

5、；在分離過(guò)程中如整個(gè)心臟始終蒼白，則細(xì)胞數(shù)量不僅低于30%，且?guī)缀鯖](méi)有耐鈣細(xì)胞。 （2）正常大鼠心室肌細(xì)胞RP、AP和離子流：a.外膜、中膜和內(nèi)膜心室肌細(xì)胞RP分別為—75.8±9.5 mV（n=87）、—76.3±8.4 mV（n=75）和—75.4±7.8 mV（n=68），差異無(wú)顯著性（P>0.05）。b.外膜25%、50%和90%動(dòng)作電位時(shí)程（APD）分別為3.6±1.2ms、10.3±2.1ms和46.3±4.8ms（

6、n=50）；中膜APD25、APD50和APD90分別為6.4±1.8ms、14.7±2.4ms和69.4±8.3ms（n=58）；內(nèi)膜APD25、APD50和APD90分別為13.8±2.1ms、45.3±10.2ms和152.1±33.4ms（n=62），外膜、中膜和內(nèi)膜心室肌細(xì)胞APD差異有顯著性（P<0.05）。c.外膜、中膜和內(nèi)膜Ito峰值電流和電流密度不同，在+70mV刺激時(shí)電流大小分別為8925.0±2399.3pA（n=

7、57）、4373.1±830.2pA（n=51）和1843.3±542.4pA（n=60），相應(yīng)電流密度分別為59.50±15.99 pA/pF、29.15±5.53 pA/pF和12.29±3.62pA/pF，差異有顯著性（P<0.05），但外膜、中膜和內(nèi)膜心室肌細(xì)胞Ito半激活電壓、半失活電壓及失活后恢復(fù)時(shí)間均無(wú)差異（P>0.05，n=6～8）。d.外膜、中膜和內(nèi)膜INa、ICa—L、Ik和Ik1峰值電流、電流密度、電流電壓（I—V

8、）曲線形態(tài)、穩(wěn)態(tài)激活曲線、穩(wěn)態(tài)失活曲線和失活后恢復(fù)曲線無(wú)差別（P>0.05，n=6～10）。 （3）氨氯地平對(duì)心室肌細(xì)胞RP、AP和離子流影響：a.加入0.1、0.5、1、5和10μmol/L左旋、右旋和消旋Aml后，RP、AP最大上升速率、AP幅度和AP超射差異無(wú)顯著性（P>0.05，n=8～10），但加入上述濃度左旋Aml后，APD25分別為11.0±1.7ms、10.4±1.6ms、9.2±1.4ms、6.9±1.0ms和

9、4.6±0.7ms（P<0.05，n=12）；APD50分別為36.2±8.2ms、33.9±7.7ms、30.2±6.8ms、22.6±5.1ms和15.1±3.4ms（P<0.05，n=12）；APD90分別為121.6±26.7ms、114.0±25.0ms、101.4±22.2ms、76.1±16.7ms和50.7±11.1ms（P<0.05，n=7）。加入上述濃度消旋Aml后，APD25分別為12.4±1.9ms、10.6±1

10、.6ms、9.8±1.5ms、8.0±1.2ms和6.9±1.0ms（P<0.05，n=10）；APD50分別為39.2±9.2ms、36.7±7.9ms、33.8±7.2ms、25.4±5.9ms和21.7±5.2ms（P<0.05，n=10）；APD90分別為138.9±30.1ms、125.4±25.8ms、110.5±23.6ms、88.7±19.5ms和76.8±14.7ms（P<0.05，n=8）。但加入不同濃度右旋Aml后

11、，APD無(wú)明顯改變（P>0.05，n=9）。b.加入0.1、0.5、1、5和10μmol/L左旋和消旋Aml后，ICa—L呈濃度依賴性阻滯、I—V曲線上移、穩(wěn)態(tài)激活曲線和穩(wěn)態(tài)失活曲線左移、失活后恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，在維持電位（HP）—40mV時(shí)，上述濃度左旋Aml對(duì)ICa—L阻滯分別為1.5±0.2%、25.4±5.3%、65.2±7.3%、78.4±8.1%，和94.2±5.0%（P<0.05，n=10），左旋Aml對(duì)ICa—L阻滯半效抑制

12、濃度（IC50）為0.62±0.12μmol/L；上述濃度消旋Aml對(duì)ICa—L阻滯分別為0.9±0.1%、10.4±3.2%、69.1±5.3%、75.2±7.0%和81.6±6.4%（P<0.05，n=8），IC50為1.32±0.04μmol/L。 （4）氨氯地平對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響：加入1、5、10、50和100μmol/L左旋Aml后，心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低1.1±0.1%、15.3±3.8%、58

13、.1±5.2%、73.5±5.7%和88.9±7.2%，IC50為8.13±1.02μmol/L（P<0.05，n=10）；加入上述相同濃度消旋Aml后，心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低0.6±0.1%、5.1±2.0%、15.2±3.7%、65.8±4.1%和72.1±5.2%，IC50為16.19±2.05μmol/L（P<0.05，n=8）；但不同濃度右旋Aml對(duì)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)影響（P>0.05，n=8）。 （5）

14、氨氯地平對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響：加入0.1、0.5、1、5和10μmol/L左旋Aml后，平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低10.3±1.2%、35.2±3.5%、60.1±5.0%、78.9±6.1%和91.2±7.6%，IC50為0.72±0.10μmol/L（P<0.05，n=8）；加入上述濃度消旋Aml后，平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別降低3.4±0.8%、20.7±2.1%、36.4±3.3%、68.9±5.4%和81.

15、3±6.2%，IC50為1.51±0.21μmol/L（P<0.05，n=6）；但加入上述濃度右旋Aml，平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)變化（P>0.05，n=6）。 結(jié)論：（1）在大鼠心室肌細(xì)胞分離過(guò)程中，如嚴(yán)格按照“四步”酶消化法，可獲得大量具有正常電生理特性的耐鈣心室肌細(xì)胞。 （2）正常大鼠外膜、中膜和內(nèi)膜心室肌細(xì)胞APD和Ito存在分層分布特點(diǎn)，由外膜至內(nèi)膜APD逐漸延長(zhǎng)，Ito逐漸減小，而INa、ICa—L、Ik和I

16、k1不存在分層分布特點(diǎn)。 （3）a.左旋和消旋Aml對(duì)ICa—L有阻滯作用，且相同濃度左旋Aml對(duì)ICa—L和通道動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響比消旋Aml更明顯，而右旋Aml對(duì)ICa—L無(wú)阻滯作用。b.左旋Aml和消旋Aml通過(guò)阻滯ICa—L縮短APD，而右旋Aml對(duì)ICa—L無(wú)阻滯作用，故不同濃度右旋Aml對(duì)APD無(wú)影響。c.低濃度左旋和消旋Aml對(duì)INa無(wú)阻滯作用，高濃度左旋和消旋Aml可阻滯INa，但不同濃度右旋Aml對(duì)lNa均無(wú)阻滯作

17、用。d.不同濃度左旋、右旋和消旋Aml對(duì)Ito、k和Ik1電流大小和通道動(dòng)力學(xué)參數(shù)均無(wú)影響。 （4）左旋和消旋Aml可通過(guò)阻滯L—型鈣離子通道降低心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，右旋Aml對(duì)L—型鈣通道無(wú)阻滯作用，故對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無(wú)影響。 （5）a.通過(guò)“兩步”酶消化法，可獲得量多質(zhì)優(yōu)的大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。b.與大鼠心室肌細(xì)胞相比，左旋和消旋Aml更易通過(guò)阻滯動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上L—型鈣離子通道，從而降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)