1、微核實驗是反映染色體損傷的重要實驗方法，其在敏感性、特異性、準(zhǔn)確性方面與經(jīng)典的染色體畸變分析方法基本相當(dāng)，卻更加經(jīng)濟(jì)、簡單、快速，因此，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境等多領(lǐng)域的遺傳毒性評估，并作為一種生物標(biāo)志物監(jiān)測暴露于有害職業(yè)和生活環(huán)境中的人群遺傳損害。隨著環(huán)境污染的日趨嚴(yán)重，關(guān)于微核實驗自動化檢測技術(shù)的研究成為毒理學(xué)領(lǐng)域中倍受關(guān)注的一個熱點，而其中微核流式細(xì)胞術(shù)較為成熟。當(dāng)前微核流式細(xì)胞術(shù)檢測法有外周血CD71-FTTC/PI聯(lián)合

2、染色法及以異染性熒光染料吖啶橙(AO)為染料的檢測法，前者將感染瘧原蟲的紅細(xì)胞作為儀器的內(nèi)標(biāo)以減小誤差，但步驟繁瑣、耗時較長，不利于早期診斷、及時治療；后者則步驟簡單、耗時較短，能夠及時報告檢測結(jié)果，為被檢對象的早期診斷和治療爭得寶貴時間。但該方法技術(shù)難度大，重復(fù)性不好，本實驗室針對這一缺陷，不斷改進(jìn)實驗條件，將其應(yīng)用于大鼠骨髓及人外周血的檢測，并初步作為慢性遷延性外照射的生物計量儀使用，取得較理想的效果。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對實驗

3、條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了小鼠骨髓紅細(xì)胞微核AO-FCM自動化檢測方法，并將其應(yīng)用于環(huán)磷酰胺(CP)、硝酸羥胺(HAN)、長春新堿(VCR)三種不同等級毒性化合物的檢測及低劑量(0.1-6.0Gy)急性輻射的劑量估算。同時，本研究將快速AO人工顯微鏡法加以改進(jìn)，取得較理想的效果。 本研究所得主要結(jié)果如下： 1.經(jīng)CP處理后，fMNPCE與處理劑量間呈現(xiàn)良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系，且快速AO人工顯微鏡法檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)Giemsa法檢測

4、結(jié)果具有良好的相關(guān)性(r=0.978，P＜0.01)；AO-FCM檢測結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)Giemsa法也具良好相關(guān)性(r=0.973，P＜0.01)。AO-FCM法檢測的fMNNCE隨著劑量增加呈上升趨勢；％Ret隨劑量增加而降低，AO人工顯微鏡法與AO-FCM法檢測結(jié)果具良好相關(guān)性(r=0.808，P＜0.01)。 2.經(jīng)HAN處理后，小鼠骨髓fMNPCE呈上升趨勢，但與對照組比較無顯著性差異，快速AO人工顯微鏡法與AO-FCM法檢測

5、的結(jié)果之間具良好的相關(guān)性(r=0.993，P＜0.01)；％Ret隨劑量增加呈上升趨勢，但與對照組無顯著性差異，兩種方法檢測的結(jié)果之間具有相關(guān)性(r=0.608，P＜0.01)；外周血的fMNPCE及％Ret變化趨勢與骨髓相同。 3.經(jīng)VCR處理后，小鼠骨髓fMNPCE隨著劑量增加而升高，與陰性對照組比較有顯著性差異，快速AO人工顯微鏡法與AO-FCM法檢測的結(jié)果之間具良好的相關(guān)性(r=0.909，P＜0.01)；AO-FCM法

6、檢測的fMNNCE隨著劑量增加呈上升趨勢；％Ret隨著劑量增加而降低，與陰性對照組比較有顯著性差異，兩種方法檢測結(jié)果之間具有良好相關(guān)性(r=0.857，P＜0.01)；外周血的變化趨勢與骨髓相同。 4.經(jīng)X射線處理后，小鼠骨髓紅細(xì)胞微核率隨著劑量增加而增加，與輻射劑量之間呈現(xiàn)良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系和時間-反應(yīng)關(guān)系?？焖貯O人工顯微鏡法與AO-FCM法檢測的結(jié)果之間具良好的相關(guān)性(6h相關(guān)系數(shù)為r=0.806，P＜0.01；12h為

7、r=0.562，P＜0.01：24h為r=0.744，P＜0.01)；輻照組全部數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)為r=0.757(P＜0.01)：AO-FCM法檢測的fMNNCE隨著劑量增加呈上升趨勢；％Ret隨著輻射劑量的增加而下降，與輻射劑量之間呈現(xiàn)出劑量-反應(yīng)關(guān)系和時間-反應(yīng)關(guān)系，兩種方法檢測結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)為r=0.676(P＜0.01)；輻射劑量與fMNPCE及％Ret之間的曲線擬合方程均為線性一次方程。 初步得出以下結(jié)論：

8、1.快速AO人工顯微鏡法比標(biāo)準(zhǔn)Giemsa法省時、省力，可作為小型實驗室及小樣本檢測的首選方法推薦使用。 2.AO-FCM自動化檢測方法既可監(jiān)測作用強(qiáng)而迅速的染色體斷裂劑及紡錘體毒劑所致的遺傳損害，又可監(jiān)測作用弱而緩慢的中等毒性化合物所致遺傳損害，比人工顯微鏡法更客觀、更靈敏，是一種高通量的快速檢測法，可作為大樣本量檢測的首選方法。 3.AO-FCM自動化檢測方法可作為監(jiān)測輻射早期遺傳損害的生物計量儀應(yīng)用，較其它生物計量