1、目的:采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，建立椎動(dòng)脈缺血型頸椎病(Cervical Spondylosis of Vertebral Artery,CSA)肝陽化風(fēng)證和肝陽上亢證及健康對(duì)照組高分辨率的二維凝膠電泳圖譜，比較3組蛋白質(zhì)組的表達(dá)異同，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索，初步確定椎動(dòng)脈缺血型頸椎病肝陽化風(fēng)證患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中差異表達(dá)的蛋

2、白質(zhì)，從同病異證的角度為闡明中醫(yī)肝陽化風(fēng)證的本質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 方法:設(shè)頸椎病肝陽化風(fēng)證組、頸椎病肝陽上亢證組及健康人對(duì)照組3組，取外周靜脈血分離單個(gè)核細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色獲取凝膠圖譜，以PDQuest V7.3.1軟件對(duì)三組表達(dá)圖譜進(jìn)行差異分析，選定差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase

3、 chain reaction,RT-PCR)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)蛋白中的(纖)絲狀肌動(dòng)蛋白成帽蛋白β(F-actin caping proteinsubunit beta，CAPZ-β)在mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果: 1.各組PBMCs總蛋白2-DE圖譜建立及差異蛋白質(zhì)識(shí)別：分別獲得了頸椎病肝陽化風(fēng)證組、肝陽上亢證組、健康人組PBMCs總蛋白2-DE圖譜，通過PDQuest7.3.1分析軟件進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)，獲得了三組圖譜的蛋白

4、質(zhì)點(diǎn)數(shù)，健康組587個(gè)，肝陽化風(fēng)證組622個(gè)，肝陽上亢證組584個(gè)。通過比較分析，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為19個(gè)，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定出14種蛋白質(zhì)。肝陽化風(fēng)組與正常組比較，發(fā)現(xiàn)16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在肝陽化風(fēng)證組中差異表達(dá)，3個(gè)表達(dá)上調(diào)，10個(gè)表達(dá)下調(diào)，3個(gè)缺失。肝陽上亢證組與正常組比較，發(fā)現(xiàn)12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在肝陽上亢證組中差異表達(dá)，2個(gè)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)，4個(gè)缺失。肝陽化風(fēng)證組與肝陽上亢證組比較，分析發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，3個(gè)表達(dá)相同蛋白

5、質(zhì)點(diǎn)。鑒定出的蛋白質(zhì)涉及凋亡相關(guān)蛋白、抗氧化蛋白、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、假想和未知蛋白等。 2.RT-PCR驗(yàn)證差異蛋白CAPZ-β表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，肝陽上亢證組和肝陽化風(fēng)證組CAPZ-β表達(dá)量均明顯增加(P<0.05)，肝陽上亢證組與肝陽化風(fēng)證組比較，后者CAPZ-β表達(dá)量明顯高于肝陽上亢證組(P<0.05)，與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。 結(jié)論: 1.初步建立了椎動(dòng)脈缺血型頸椎病肝陽化風(fēng)證和肝陽上

6、亢證的雙向凝膠電泳圖譜。 2.椎動(dòng)脈缺血型頸椎病肝陽上亢證與肝陽化風(fēng)證(肝陽風(fēng)化證由肝陽上亢證發(fā)展而來)有相同表達(dá)的蛋白，提示同病異證有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，但肝陽上亢與肝陽化風(fēng)為中醫(yī)不同證型，兩組圖譜及蛋白質(zhì)表達(dá)具有明顯差異，提示肝陽化風(fēng)證和肝陽上亢證又有不同的本質(zhì)內(nèi)涵。 3.CAPZ-β的RT-PCR結(jié)果驗(yàn)證與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致，證明了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的穩(wěn)定性及結(jié)果的可靠性。肝陽上亢證與肝陽化風(fēng)證均有CAPZ-β表達(dá)上調(diào)