1、目的： 構建重組瘦素基因(Leptin)真核表達質粒pTraceTM-Leptin；轉染SD大鼠骨髓基質細胞(marrow stromal cell，MSCs)，研究Leptin基因對MSCs增殖分化的影響。 方法： 提取人脂肪組織總RNA，根據(jù)GeneBank公布的Leptin基因序列設計合成一對引物，采用RT-PCR技術克隆Leptin基因，酶切后重組到帶有GFP標記的pTracerTM-CMV/Bsd載體上

2、，構建重組基因真核質粒pTracerTM-Leptin。采用密度梯度離心法體外獲得SD大鼠的骨髓基質細胞，將重組真核質粒pTracerTM-Leptin通過脂質體轉染法轉染骨髓基質細胞，以抗生素Blasticidin加壓篩選獲得Leptin基因修飾的轉基因細胞株，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察轉基因細胞形態(tài)，采用分子生物學法(RT-PCR法)和免疫學法(Western blot法)分別從mRNA水平和蛋白質水平檢測目的基因在轉基因細胞中的轉

3、錄和翻譯，MTT法檢測Leptin基因對MSCs的生長增殖情況，ELISA法檢測轉基因細胞上清骨鈣素(OC)分泌水平，并采用對硝基苯磷酸鹽(PNP)試劑盒測定轉基因細胞堿性磷酸酶(ALP)活力，半定量RT-PCR法檢測轉基因細胞中成骨細胞分化相關基因Cbfαl和Cbfβ的表達。 結果： 成功獲得約450bp的人Leptin基因，PCR、雙酶切及序列測定結果顯示成功構建了重組基因真核質粒pTracerTM-Leptin，并

4、轉染密度梯度分離法獲得的大鼠骨髓基質細胞，加壓篩選后獲得轉基因細胞，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，并伴有細胞形態(tài)變化，實驗組的RT-PCR和Western blot結果均出現(xiàn)目的條帶，表明脂質體介導的Leptin基因可以在骨髓基質細胞中表達，且促進MSCs增殖，并有一定的時間依賴性，轉基因細胞上清中OC含量增加，ALP活力上調，成骨細胞特異性轉錄因子Cbfαl和Cbfβ mRNA表達量也增高。 結論： 本實驗成功構建了重