1、目的:
　　金線蘭(Anoectochilus roxburghii(Wall.) Lindl.)，又名花葉開(kāi)唇蘭、金線蓮、金絲草，為蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生珍稀中草藥。金線蘭具有清熱涼血、除濕解毒的功效，可治療肺結(jié)核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無(wú)力、遺精、風(fēng)濕性及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥。特別是在民間用于治療急性腎炎、小兒驚風(fēng)和風(fēng)寒濕痹等病，療效尤為顯著。金線蘭不僅具有極高的藥用價(jià)值，同時(shí)株型小巧美觀，

2、葉形優(yōu)美，金紅色葉脈網(wǎng)狀排列，也具有極高的觀賞價(jià)值。但金線蘭在我國(guó)分布區(qū)域較窄，對(duì)生存環(huán)境依賴(lài)性高，自然蘊(yùn)藏量少，且自然繁殖非常困難，加上人們的不斷采挖和對(duì)自然環(huán)境的破壞等，野生資源已近瀕危狀態(tài)。因此，為使金線蘭資源能夠可持續(xù)利用，運(yùn)用植物組培技術(shù)建立金線蘭離體快繁體系，進(jìn)而推動(dòng)人工種植發(fā)展，能有效解決其資源短缺問(wèn)題。隨著我國(guó)稀土資源在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用廣泛深入，越來(lái)越多的研究證明，適宜濃度的稀土元素對(duì)植物生長(zhǎng)有一定的刺激作用，能促進(jìn)植物

3、的新陳代謝活動(dòng)，促進(jìn)葉和根的生長(zhǎng)及根系對(duì)養(yǎng)分的吸收等。因此，本研究通過(guò)將稀土元素(鑭La、鈰Ce)應(yīng)用于金線蘭的離體培養(yǎng)，考察不同濃度的鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)的影響，改進(jìn)和完善其離體再生技術(shù)，從而獲得品質(zhì)優(yōu)良、生長(zhǎng)健壯的試管苗并縮短培養(yǎng)周期。同時(shí)研究稀土鑭、鈰對(duì)金線蘭組培苗中葉綠素、根系活力、NR酶、SOD酶、POD酶、CAT酶、MDA等生理指標(biāo)含量和有效化學(xué)成分總黃酮、天麻素等含量影響，以期揭示稀土鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)可能的作用機(jī)理

4、。
　　方法:
　　本研究通過(guò)建立金線蘭離體繁殖體系，探討稀土元素鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)的影響以及稀土鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)可能的作用機(jī)理，具體包括以下工作:
　　1.建立金線蘭野生種子的無(wú)菌萌發(fā)體系，并探討不同種類(lèi)的基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、MS改良)，不同種類(lèi)、濃度的有機(jī)添加物和植物激素，不同外植體材料對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而建立良好的金線蘭組培快繁體系;
　　2.通過(guò)在金線蘭離體培養(yǎng)過(guò)程中添加不同濃

5、度的硝酸鑭、硝酸鈰以及對(duì)金線蘭的移栽種植的實(shí)驗(yàn)研究，考察不同濃度的稀土鑭、鈰對(duì)金線蘭組培苗離體生長(zhǎng)的影響;
　　3.通過(guò)對(duì)金線蘭組培苗中葉綠素、根系活力、NR酶、SOD酶、POD酶、CAT酶、MDA等生理指標(biāo)含量的測(cè)定，初步探索稀土鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)和成分積累可能的作用機(jī)理;
　　4.通過(guò)對(duì)金線蘭組培苗中總黃酮、天麻素等有效化學(xué)成分含量測(cè)定的研究，初步探索稀土鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)可能的作用機(jī)理。
　　結(jié)果:

6、>　　1.金線蘭離體快繁體系的建立
　　成熟的金線蘭野生種子作為實(shí)驗(yàn)材料接種于1/2MS培養(yǎng)基后，種子吸水膨大呈圓球狀于30d左右開(kāi)始生長(zhǎng)為黃白色球體狀原球莖，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原球莖進(jìn)一步生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化，90d左右?guī)缀跛性蚯o均形成具有1～2片小葉的翠綠色幼苗;對(duì)于不同培養(yǎng)基的篩選，金線蘭于1/2MS基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況較在MS和改良MS基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況要好;對(duì)于添加有機(jī)添加物對(duì)金線蘭的離體生長(zhǎng)影響研究，結(jié)果表明，1

7、00 g/L的土豆汁、50 g/L的香蕉汁和15 g/L馬鈴薯粉對(duì)金線蘭頂芽的生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用;對(duì)于添加外源激素對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)的影響研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA濃度在1.0 mg/L時(shí)的試管苗生長(zhǎng)較好，葉片較大，而且側(cè)芽數(shù)量較少，而NAA的濃度為1.5 mg/L時(shí)更有利試管苗增長(zhǎng);適宜金線蘭中部莖段離體生長(zhǎng)的最適宜TDZ濃度為2.0 mg/L，而對(duì)于基部莖段，在培養(yǎng)前期（3-4個(gè)月內(nèi)），適合莖段芽增殖的TDZ濃度為4.0 mg/L

8、，在培養(yǎng)后期（4個(gè)月后），將TDZ濃度降為2.0 mg/L更適宜金線蘭基部莖段的離體生長(zhǎng);莖段愈傷組織最佳激素配比可初步斷定為1.0mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L ZT+0.2 mg/L2，4-D，該結(jié)果愈傷組織誘導(dǎo)率最大達(dá)到90.7％;葉片愈傷組織最佳激素配比可初步斷定為1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.2 mg/L ZT+0.2 mg/L2，4-D，該結(jié)果愈傷組織誘導(dǎo)率最大達(dá)到90.

9、0％。
　　2.稀土元素對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)的影響研究
　　在一定濃度范圍內(nèi)，隨著硝酸鑭、硝酸鈰濃度的升高，稀土元素鑭、鈰對(duì)組培苗生長(zhǎng)呈促進(jìn)作用，當(dāng)超過(guò)一定濃度時(shí)，隨著硝酸鑭、硝酸鈰濃度的升高，對(duì)金線蘭的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用。綜合考慮，添加2.0 mg/L的硝酸鑭或硝酸鈰較適宜金線蘭初萌發(fā)小苗離體生長(zhǎng)，其組培苗的平均株高和平均單株鮮重均達(dá)到最大值;添加5.0mg/L的硝酸鑭或2.0 mg/L硝酸鈰較適宜金線蘭頂芽的離體生長(zhǎng);添加1

10、.0 mg/L硝酸鈰較適宜金線蘭中部莖段的離體培養(yǎng)，此時(shí)，中部莖段芽的增殖倍數(shù)為1.5倍，平均芽高為3.0 cm，且誘導(dǎo)的芽生長(zhǎng)良好、芽體較大、莖粗壯、葉片大且深綠;適宜金線蘭基部莖段離體生長(zhǎng)的條件為3.0 mg/L的硝酸鈰，此時(shí)，基部莖段誘導(dǎo)的芽的增殖倍數(shù)達(dá)到最大為5.1倍，平均芽高為4.5cm，且誘導(dǎo)的芽生長(zhǎng)良好、芽體較大、莖粗壯、葉片大且深綠。本研究結(jié)果表明，適宜濃度的稀土元素鑭、鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。
　　3

11、.稀土元素對(duì)組培金線蘭生理指標(biāo)含量的影響研究
　　在添加0～5.0 mg/L硝酸鑭、硝酸鈰的濃度范圍內(nèi)，金線蘭各生理指標(biāo)含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，先隨稀土元素濃度上升（0～2.0 mg/L）而上升后隨濃度上升(2.0～5.0 mg/L)而下降，當(dāng)硝酸鑭和硝酸鈰的添加濃度均為2.0 mg/L時(shí)，其葉綠素含量分別高出空白對(duì)照組葉綠素含量的38.5％和44.2％;其根系活力分別是空白對(duì)照組根系活力的2.88倍和3.07倍;其N(xiāo)R酶活力分別

12、高出空白對(duì)照組NR酶活力的19.9％和50.7％; SOD酶活力達(dá)到最高分別為25.13 unit/mgprot和23.88 unit/mgprot，分別高出空白對(duì)照組SOD酶活力的31.4％和25.1％; CAT酶活力達(dá)到最高分別為13.73unit/mgprot和17.07 unit/mgprot，分別是空白對(duì)照組CAT酶活力的1.83倍和2.28倍;POD酶活力達(dá)到最高分別為21.22 unit/mgprot和32.89 unit

13、/mgprot，分別是空白對(duì)照組POD酶活力的1.52倍和2.35倍;而在添加0～5.0 mg/L硝酸鑭、硝酸鈰的濃度范圍內(nèi)，MDA含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，先隨稀土元素濃度上升(0～2.0mg/L)而下降后隨濃度上升(2.0～5.0 mg/L)而上升，當(dāng)硝酸鑭和硝酸鈰的添加濃度均為2.0 mg/L時(shí)，其MDA含量降至最低分別為2.84 nmol/mgprot和2.99nmol/mgprot，而空白對(duì)照組MDA含量為3.48 nmol

14、/mgprot。本研究結(jié)果認(rèn)為一定濃度的硝酸鑭、硝酸鈰能增加組培金線蘭一些生理指標(biāo)含量。并初步認(rèn)為硝酸鑭、硝酸鈰對(duì)金線蘭離體生長(zhǎng)的作用機(jī)理可能是:一定濃度稀土元素鑭、鈰能夠影響植物體內(nèi)葉綠素含量、根系活力、細(xì)胞膜透過(guò)性以及相關(guān)大分子生物酶活性，從而增強(qiáng)植物的光合速率、以及植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用等，最終促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，并對(duì)植物的品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。
　　4.稀土元素對(duì)組培金線蘭有效化學(xué)成分含量的影響研究
　　在添加0～5.

15、0 mg/L硝酸鑭和硝酸鈰的濃度范圍內(nèi)，金線蘭總黃酮含量呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢(shì)，總黃酮含量先隨稀土元素濃度上升(0～2.0 mg/L)而上升后隨其濃度上升(2.0～5.0 mg/L)而下降。硝酸鑭實(shí)驗(yàn)組以添加2.0 mg/L濃度最佳，此時(shí)金線蘭總黃酮含量為8.15 mg/g，高出未添加稀土元素組總黃酮含量的37.4％;硝酸鈰實(shí)驗(yàn)組以添加2.0 mg/L濃度最佳，此時(shí)金線蘭總黃酮含量為10.48 mg/g，高出未添加稀土元素組總黃酮含

16、量的76.7％。
　　結(jié)論:
　　利用成熟的金線蘭野生種子作為實(shí)驗(yàn)材料，建立金線蘭種子的無(wú)菌萌發(fā)體系，通過(guò)對(duì)不同基本培養(yǎng)基，不同種類(lèi)、濃度的有機(jī)添加物和植物激素，不同外植體材料等影響因素的優(yōu)化篩選，改進(jìn)和完善了其離體再生技術(shù)，建立了良好的金線蘭組培快繁體系，并獲得了品質(zhì)優(yōu)良、生長(zhǎng)健壯的試管苗，幫助解決了金線蘭資源短缺問(wèn)題，同時(shí)為金線蘭工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，為其資源的可持續(xù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。而適宜濃度的稀土元素鑭、鈰對(duì)金線蘭的