1、PSP-II是公豬精漿中含量較高的蛋白，且在豬副性腺特異表達(dá)并分泌到精液中，為了建立豬副性腺特異表達(dá)載體，根據(jù)已發(fā)表的PSP-II5’和3’-調(diào)控區(qū)序列設(shè)計兩對引物并引入酶切位點，用高保真PCR擴(kuò)增了豬PSP-II蛋白基因的5’端和3’端的調(diào)控元件及啟動子，長度分別約為4.1kb和3.1kb，并將PSP-II5’和3’-調(diào)控區(qū)序列分別克隆到pMD18-T Vector上，將插入目的片段重組質(zhì)粒送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果

2、Blast程序與已發(fā)表的序列的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比對，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增的PSP-II5’端和3’端調(diào)控區(qū)前500bp與已發(fā)表的序列的同源性為99.8％、100％。為了建立豬附性腺暫態(tài)生物反應(yīng)器，我們將已經(jīng)克隆的PSP-II基因5’端和3’端調(diào)控序列，應(yīng)用體外DNA重組技術(shù)連接到改造過的pcDNA3.0上，經(jīng)鑒定將正確的目的克隆命名為pC，然后將報告基因EGFP插入pC載體的PSP-II5’側(cè)翼區(qū)下游和3’側(cè)翼區(qū)上游。為確定建立的載體是否表達(dá)

3、及表達(dá)的特異性，將pC-EGFP質(zhì)粒及陽性對照pEGFP-N1質(zhì)粒分別經(jīng)PEI包裹手術(shù)轉(zhuǎn)染ICR小鼠精囊腺，轉(zhuǎn)染48h后，取小鼠精囊腺并提取mRNA用RT-PCR方法和做冰凍切片用熒光顯微鏡檢測熒光蛋白基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明pC-EGFP質(zhì)?？梢则?qū)動EGFP基因的表達(dá)。為確定表達(dá)的特異性，將pC-EGFP質(zhì)粒經(jīng)PEI包裹尾靜脈全身轉(zhuǎn)染ICR小鼠，轉(zhuǎn)染48h后，取精囊腺、肝臟、心臟、肺和肌肉提mRNA和做冰凍切片，用RT-PCR方法和熒