1、目的：①檢測歧異同源盒基因Dlx 家族在MC3T3-E1 細胞成骨分化中的表達譜，篩選與成骨分化相關(guān)性密切的Dlx 家族成員作為候選研究基因。②探討候選研究基因過表達對MC3T3-E1 細胞成骨分化的調(diào)控作用。③探討候選研究基因過表達對MC3T3-E1 細胞周期和凋亡的影響。
　　 方法：首先建立MC3T3-E1 細胞誘導成骨分化模型，采用real-time RT-PCR方法鑒定內(nèi)源性Dlx 基因家族6 個成員在成骨分化不同時期

2、的表達譜，篩選出與成骨分化趨勢相關(guān)性大的Dlx 基因成員（本研究中發(fā)現(xiàn)的是Dlx2 基因）。然后構(gòu)建Dlx2 過表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，測序驗證。體外病毒轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 后，以嘌呤霉素行抗性篩選穩(wěn)定細胞株, 建立穩(wěn)定過表達Dlx2 基因的MC3T3-E1-Dlx2 細胞成骨分化模型，并以RT-PCR 和Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后細胞中Dlx2 的表達譜。接下來，在穩(wěn)定過表達Dlx2 基因細胞模型中，應用real-timeR

3、T-PCR 檢測Dlx2 過表達對部分成骨相關(guān)基因（ALP，OCN，Runx2，Msx2）表達的影響；以堿性磷酸酶（ALP）活性測定和茜素紅染色法檢測Dlx2 過表達對成骨分化的影響；最后，分別利用PI/Rnase 和Annexin V/PI 染色后的流式細胞分選技術(shù)，檢測Dlx2 基因過表達對細胞周期和凋亡的影響。
　　 結(jié)果：⑴確定Dlx 基因家族6 個成員在MC3T3-E1 細胞成骨分化不同時期細胞內(nèi)的表達譜，發(fā)現(xiàn)Dlx2

4、 基因與成骨分化趨勢相關(guān)性較大，作為研究候選基因。⑵成功構(gòu)建并鑒定獲得Dlx2 過表達的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。該病毒載體體外轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細胞后篩選出Dlx2 穩(wěn)定過表達細胞株MC3T3-E1-Dlx2，其mRNA 和蛋白表達量明顯高于對照組。在成骨誘導過程中，MC3T3-E1-Dlx2 細胞ALP 值在第4d、7d、14d 均高于對照組細胞，茜素紅染色顯示實驗組較對照組和空白組染色深。Dlx2 過表達于成骨誘導早期就能顯著促進ALP

5、 和 Msx2 的表達（P＜0.05），晚期則上調(diào)OCN 表達（P＜0.05），而Runx2 表達無明顯變化（P＞0.05）。⑶在Dlx2 基因穩(wěn)定過表達細胞系MC3T3-E1-Dlx2 中，PI/Rnase 染色后流式細胞分選顯示實驗組較對照組G1/G0 期細胞比例增加（P＜0.05），S 期和G2/M期細胞比例減少（P＜0.05＝。Annexin V/PI 染色后的流式細胞分選顯示實驗組較對照組早期凋亡和晚期凋亡均有明顯增加（P＜0