1、目的
　　冠狀動脈粥樣硬化常伴隨著患者的高血糖癥，患者血管內血糖濃度較高。一般認為，高血糖常抑制內皮細胞增殖，促進內皮細胞凋亡。糖尿病與早期心血管疾病間的關系得到確認，高血糖是內皮功能障礙的主要原因。
　　目前臨床上廣泛應用使用的316L不銹鋼支架材料含有鎳離子，鎳離子具有致敏、致癌和誘發(fā)血栓等毒副作用。其炎癥反應刺激了支架周圍血管損傷部位細胞異常，研究認為316L不銹鋼中的鎳離子釋放引起的接觸過敏加重了炎癥反應，刺激支架周

2、圍新生組織的增生，增大了再狹窄的可能性。HNNF(Highnitrogennickelfree，HNNF)新型不銹鋼金屬是一種去除鎳元素添加氮元素的支架材料。
　　本論文通過結合高血糖環(huán)境下血管內皮細胞在不同金屬支架材料上的增殖狀況，研究HUVEC細胞的細胞形態(tài)、細胞生長活性、細胞凋亡、細胞周期和基因表達等方面的影響，比較兩種不銹鋼金屬支架材料在支架再狹窄方面的優(yōu)劣，為新型支架材料的開發(fā)和改良提供實驗基礎。
　　實驗材料與方

3、法
　　1、高糖損傷模型的建立:
　　向含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中添加D-(+)-Glucose右旋葡萄糖配制5組梯度濃度的培養(yǎng)基。其葡萄糖含量終濃度分別為10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L，30mmol/L，為高糖組。普通RPMI-1640培養(yǎng)液為對照組。取處于對數(shù)生長期HUVEC細胞制成細胞懸液，以1×104/孔的細胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，于37℃，5％CO2

4、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的1、3、5和7天進行CCK-8檢測，每組設3個復孔，用酶聯(lián)免疫檢測儀與450nm波長處測定沒孔的OD值。求出每組3個孔的平均OD值，然后計算細胞相對增值率(relativegrowthrate，RGR)，RGR=（實驗組OD值/對照組OD值×100％）。
　　2、觀察細胞生長狀況:
　　將體外培養(yǎng)的HUVEC細胞制成細胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，加入30mmol/L高糖培養(yǎng)液，將24孔

5、培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，待細胞細胞基本長成單層，取出長有細胞的金屬片，用姬姆薩染液進行細胞染色，置于金相顯微鏡下觀察HUVEC細胞的生長狀況。從形態(tài)上觀察高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不同金屬材料對HUVEC細胞生長狀況的影響
　　3、細胞生長活性的測定:
　　取處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞，成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后

6、的1、3、5天取樣，通過CCK-8比色法測定細胞的生長活性，用酶聯(lián)免疫檢測儀于450nm波長處測定每孔的OD值，求出每一組的平均OD值。計算細胞的相對增值率(relativegrowthrate，RGP)，對各組結果進行評價。定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不銹鋼金屬支架材料對HUVEC細胞增殖及細胞生長活性的影響。
　　4、細胞周期分析:
　　取處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞，成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，

7、各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細胞均在開始培養(yǎng)7天后用不含血清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)22h，再更換為含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時間點分別取樣，并收集細胞置于離心管中，通過流式細胞儀進行細胞周期分析。定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不銹鋼金屬支架材料對HUVEC細胞細胞周期的影響。
　　5、細胞凋亡檢測
　　取處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞，成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組

8、均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細胞置于離心管中通過流式細胞儀對細胞凋亡進行檢測，定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不同不銹鋼金屬支架材料對HUVEC細胞凋亡的影響。
　　6、實時定量PCR檢測
　　取處于對數(shù)生長期的HUVEC細胞，制成細胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細胞置于1.5mL離心管中，

9、做好標記。按照TRIzol說明書的要求提取RNA，測定各組RNA純度和濃度。按照Takara試劑盒說明書的要求，反轉錄得到DNA模板，并按照要求進行Real-TimePCR的檢測。以基因GAPDH作為內參，定量分析高糖環(huán)境下316L和0.62N兩種不銹鋼金屬支架材料對HUVEC細胞基因水平表達的影響。
　　結果
　　1、在不同糖濃度下對HUVEC細胞通過鏡下觀察、CCK-8細胞活力測定、SOD測定和MDA測定，30mmol/

10、L濃度下是考察高糖環(huán)境下細胞增殖理想濃度。
　　2、通過鏡下觀察、CCK-8實驗和對高糖環(huán)境下細胞增殖活性的檢測，及流式細胞儀下細胞周期的檢測可以看出培養(yǎng)在0.62N不銹鋼金屬材料上的HUVEC細胞生長活性低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的HUVEC細胞(P＜0.05)，且均高HUVEC細胞在體外培養(yǎng)的正常水平。
　　3、通過流式細胞儀對細胞凋亡的檢測可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細胞培養(yǎng)7天后細胞早期

11、凋亡和晚期凋亡比例高于0.62N不銹鋼金屬支架才上的HUVEC細胞。
　　4、通過實時定量PCR檢測的結果可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細胞凋亡相關的基因caspase3、caspase8和FAS的基因表達水平高于0.62N組(P＜0.05)，而caspase9中的基因表達水平，0.62N組高于316L（P＜0.05）;自噬相關的基因ATG5、ATG7、ATG12中，316L組基因表達量高于0.62N組(P＜0

12、.05);細胞周期相關基因cyclinE和cyclinA中，0.62N組基因表達量高于316L組。
　　結論
　　1、通過細胞形態(tài)的觀察、細胞生長活性、細胞周期和細胞凋亡以及實時定量PCR的檢測結果，發(fā)現(xiàn)0.62N不銹鋼金屬材料具有促進血管內皮細胞增殖的作用。
　　2、與316L不銹鋼金屬支架材料相比，0.62N在成分上去除了鎳元素對細胞的潛在毒性作用，可能是其相較于316L不銹鋼金屬支架材料具有促進血管內皮細胞增殖的