1、目的:炎癥性肺病以肺內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),炎癥介質(zhì)釋放,進(jìn)而引起促炎/抗炎系統(tǒng)失衡為特征的肺臟疾病。長(zhǎng)期以來糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GC)作為抗炎藥用于炎癥性肺病的治療,但其個(gè)體療效存在差異,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未明了。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolarmacrophage,AM)是主要炎癥細(xì)胞之一,在炎癥性肺病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素的主要活

2、性成分,能夠刺激機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì),促進(jìn)炎癥性肺病的發(fā)展。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子-3(Signal transducers and activatorsof transcription-3,STAT3)的激活可以抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)以小鼠AM為研究對(duì)象,觀察地塞米松(dexamethasone,DEX)對(duì)LPS刺激的上述細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10的影響,初步探討STAT3在地塞米松對(duì)小鼠AM分泌TNF-α及IL-10影響

3、中的作用,為臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療炎癥性肺病提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度。培養(yǎng)MH-S細(xì)胞株,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml,隨機(jī)分組:①對(duì)照組:加入與實(shí)驗(yàn)組同體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)液;②LPS組:終濃度為100ng/ml的LPS刺激2h、6h、12h;③DEX10-6 mol/L+LPS組:終濃度為1×10-6 mol/L的DEX孵育后2h用LPS刺

4、激2h、6h、12h;④DEX10-8 mol/L+LPS組:終濃度為1×10-8 mol/L的DEX孵育后2h用LPS刺激2h、6h、12h;⑤DEX10-6 mol/L,組:終濃度為1×10-6 mol/L的DEX刺激2h、6h、12h;⑥D(zhuǎn)EX10-8 mol/L組:加入終濃度為1×10-8mol/L的DEX刺激2h、6h、12h。
　　 各組刺激成功后取細(xì)胞上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α的含量。

5、r>　　 2.ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞上清液中IL-10的濃度。方法及分組同TNF-α測(cè)定。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MH-S細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)。將MH-S細(xì)胞于培養(yǎng)板中進(jìn)行爬片,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml,隨機(jī)分組:①對(duì)照組:加入與實(shí)驗(yàn)組同體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)液;②LPS組:終濃度為100ng/ml的LPS分別刺激30min、2h、4h;③DEX+LPS組:終濃度為1×10-6mol/L的DE

6、X孵育2h后,用LPS分別刺激30min、2h、4h;④DEX組:終濃度為1×10-6mol/L的DEX分別刺激30min、2h、4h。各組細(xì)胞刺激成功后,用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組MH-S細(xì)胞中STAT3表達(dá)的變化。
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,各組比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA),有顯著性進(jìn)一步用Student-Newman.Keuls(SNK-q)檢驗(yàn),P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

7、　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞上清液中TNF-α含量的變化:LPS刺激2h(164.29±0.44)pg/ml、6h(532.90±0.99)pg/ml、12h(350.78±10.29)pg/ml均明顯高于對(duì)照組(30.81±3.81)pg/ml(P＜0.05)。DEX10-6 mol/L+LPS2h(135.07±1.08)pg/ml、DEX10-6 mol/L+LPS6h(397.65±0.49)pg/ml、DEX10-6

8、mol/L+LPS12h(351.20±1.56)pg/ml、DEX10-8 mol/L+LPS2h(162.05±0.35)pg/ml、DEX10-8 mol/L+LPS6h(468.86±1.36)pg/ml、DEX10-8 mol/L+LPS12h(304.92±0.26)pg/ml均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);DEX10-6 mol/L+LPS6h組、DEX10-8 mol/L+LPS6h組較LPS6h組明顯降低(P＜0.0

9、5),且具有劑量依賴性;DEX10-6 mol/L+LPS2h組低于LPS2h組(P＜0.05),而DEX10-8 mol/L+LPS2h組較LPS2h組無明顯變化(P＞0.05);DEX10-8mol/L+LPS12h組低于LPS12h組(P＜0.05),而DEX10-6 mol/L+LPS12h組較LPS12h組無明顯變化(P＞0.05)。
　　 2.細(xì)胞上清液中IL-10含量的變化:對(duì)照組(23.21±0.35)pg/ml

10、。LPS刺激2h(24.89±0.24)pg/ml較對(duì)照組無明顯變化(P＞0.05),6h(33.32±0.30)pg/ml、12h(44.93±0.99)pg/ml均高于對(duì)照組(P＜0.05),DEX預(yù)處理后,DEX10-6 mol/L+LPS2h(31.05±0.54)pg/ml、DEX10-6 mol/L+LPS6h(60.00±0.33)pg/ml、DEX10-6 mol/L+LPS12h(85.00±0.64)pg/ml、DE

11、X10-8 mol/L+LPS2h(27.74±0.46)pg/ml、DEX10-8 mol/L+LPS6h(54.23±0.64)pg/ml、DEX10-8 mol/L+LPS12h(78.05±0.30)pg/ml均高于對(duì)照組和LPS組(P＜0.05),其具有劑量依賴性。DEX10-6 mol/L2h(26.85±0.24)pg/ml、DEX10-6 mol/L6h(50.64±0.08)pg/ml、DEX10-6mol/L12h(

12、76.22±0.95)pg/ml、DEX10-8 mol/L6h(45.93±0.76)pg/ml、DEX10-8 mol/L12h(66.09±1.48)pg/ml均高于對(duì)照組和LPS組(P＜0.05),DEX10-8 mol/L2h(24.93±1.46)pg/ml較對(duì)照組和LPS2h組無明顯變化(P＞0.05)。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明:對(duì)照組幾乎無黃染;LPS刺激30min時(shí)細(xì)胞開始出現(xiàn)黃染,其光密度值為(0.1

13、7±0.001);LPS刺激2h時(shí)細(xì)胞黃染最強(qiáng)(0.22±0.007);LPS刺激4h時(shí)細(xì)胞黃染開始減弱(0.20±0.005);用DEX預(yù)處理后,LPS刺激引起的細(xì)胞黃染進(jìn)一步增強(qiáng),DEX+LPS30min組(0.25±0.004),DEX+LPS2h組(0.34±0.011),DEX+LPS4h組光密度值為(0.34±0.013)。經(jīng)單因素方差分析,各組與對(duì)照組(0.12±0.013)比較p-STAT3表達(dá)均顯著增高(P＜0.05)

14、;與LPS組比較,DEX+LPS組p-STAT3表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.LPS刺激MH-S細(xì)胞后,可引起細(xì)胞上清液中的TNF-α和IL-10分泌增加,用DEX干預(yù)后,可抑制TNF-α分泌,而促進(jìn)IL-10分泌,并具有劑量依賴性。
　　 2.LPS刺激MH-S細(xì)胞后,可引起p-STAT3表達(dá)增加,而DEX能夠使p-STAT3表達(dá)更加明顯,這提示DEX可能通過p-STAT3的介導(dǎo),進(jìn)而