1、研究目的: 1.了解敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露及聯合暴露對小鼠巨噬細胞和脾淋巴細胞毒件。 2.探討敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露及聯合暴露對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響。 3.了解敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露及聯合暴露對NK細胞免疫功能的影響。 材料與方法: 1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞和小鼠脾淋巴細胞毒作用1.1受試物和細胞的選擇開展敵匹硫磷、殘殺威和雙

2、酚A進行體外非特異性免疫細胞毒性研究。采用小鼠巨噬細胞株RAW364.7細胞和小鼠脾淋巴細胞作為受試細胞。 1.2敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨及聯合暴露對RAW264.7細胞和脾淋巴細胞毒作用采用1h、4h、12h、24h、48h、72h作為受試物單獨暴露對RAW264.7細胞的染毒時間，而選用1h、2h、4h、8h、16h、24h作為受試物單獨暴露對脾淋巴細胞的染毒時間，每時間點均設計同一劑量系列。通過MTT法檢測細胞毒性。觀

3、察敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露對RAW264.7細胞和脾淋巴細胞活性的時間效應關系，確定適宜的染毒時間。觀察既定染毒時間內受試物單獨暴露的劑量效應關系，用概率單位法計算受試物的半數抑制濃度(IC50)及其95％置信區(qū)間(CI)。依據單獨暴露的IC50，將敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A按等毒性比混合，了解聯合暴露對RAW264.7細胞和脾淋巴細胞活性的劑量效應關系，求得聯合暴露的IC50。 1.3敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對R

4、AW264.7細胞和脾淋巴細胞毒性聯合作用評價根據敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露及聯合暴露IC50，采用相加系數法，評價敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A對RAW264.7細胞和脾淋巴細胞毒性的聯合作用方式。 2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞和小鼠脾NK細胞功能的影響受試物和細胞的選擇同第1章。 2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨暴露和聯合暴露對RAW264.7細胞吞噬功能影響的劑量效應關系采

5、用巨噬細胞吞噬熒光微球流式細胞術，確定敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露對RAW264.7細胞吞噬功能影響的劑量效應關系。根據單獨暴露IC50，將敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A按等毒性比混合，確定混合物的劑量效應關系。根據單獨暴露與聯合暴露的劑量效應關系，選擇適宜劑量進行2×2析因分析實驗，確定敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A的聯合作用方式。 2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨暴露和聯合暴露對脾NK細胞免疫功能影響的劑量效應關系

6、采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，研究敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A單獨暴露對小鼠NK細胞殺傷活性的劑量效應關系。根據單獨暴露IC50，將敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A按等毒性比混合，確定受試物聯合暴露的劑量效應關系。與此同時，對雌雄小鼠來源的脾NK細胞殺傷活性進行比較，以觀察受試物在體外條件下對NK細胞殺傷活性是否存在性別差異。 根據單獨暴露與聯合暴露的劑量效應關系，選擇適宜劑量進行2×2析因分析實驗，以特異性殺傷活性和反映脾活化N

7、K細胞比例的表面抗原CD69+/NKG2D+表達水平作為檢測終點，綜合判定敵匹硫磷與雙酚A、殘殺威與雙酚A的聯合作用方式。 結果: 1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨暴露和聯合暴露對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞和小鼠脾淋巴細胞的細胞毒作用1.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨及聯合暴露對RAW264.7細胞毒作用1.1.1時間效應關系敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對RAW264.7細胞存活率的影響表現為隨著染毒劑量的增加以及染毒時

8、間的延長而改變，且染毒劑量與染毒時間之間存在明顯的交互作用。根據時間效應關系研究結果，確定染毒時間為24h。 1.1.2劑量效應關系1.1.2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨暴露對RAW264.7細胞毒作用的劑量效應關系染毒24h，敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A對RAW264.7細胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷163.9mg/L(125.6mg/L～302.9mg/L)，殘殺威425.2mg/L(329.9mg/L～606

9、.4mg/L)，雙酚A34.3mg/L(30.8mg/L～38.8mg/L)。 1.1.2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A聯合暴露對RAW264.7細胞毒作用的劑量效應關系根據單獨暴露的IC50，將敵匹硫磷和雙酚A、殘殺威和雙酚A按等毒性比混合，敵匹硫磷與雙酚A混合物、殘殺威與雙酚A混合物對RAW264.7細胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷與雙酚A混合物157.3mg/L(143.7mg/L～175.8mg/L)，殘殺威與

10、雙酚A混合物258.4mg/L(238.5mg/L～281.2mg/L)。 1.1.3敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對RAW264.7細胞毒作用的聯合作用評價根據相加系數法的計算公式及判定標準，敵匹硫磷與雙酚A聯合暴露對RAW264.7細胞毒性主要表現為拮抗作用，殘殺威與雙酚A聯合暴露對RAW264.7細胞聯合毒性主要表現為相加作用。 1.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨及聯合暴露對小鼠脾淋巴細胞毒作用1.2.1時間效應關系受試

11、物對小鼠脾淋巴細胞存活率的影響表現為隨著染毒劑量的增加以及染毒時間的延長而改變，且染毒劑量與染毒時間之間存在明顯的交互作用。根據時間效應關系研究結果，確定1h為染毒時間。 1.2.2劑量效應關系1.2.2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨暴露對脾淋巴細胞毒作用的劑量效應關系染毒1h，敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A受試物單獨暴露對小鼠脾淋巴細胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷81.9mg/L(63.4mg/L～113.8mg/L)

12、，殘殺威2727.8mg/L(2512.7mg/L～2978.9mg/L)，雙酚A147.4mg/L(104.4mg/L～226.0mg/L)。 1.2.2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A聯合暴露對脾淋巴細胞毒作用的劑量效應關系根據單獨暴露的IC50，將敵匹硫磷和雙酚A、殘殺威和雙酚A按等毒性比進行混合，敵匹硫磷與雙酚A混合物、殘殺威與雙酚A混合物對RAW264.7細胞的IC50(95％CI)分別為：敵匹硫磷與雙酚A混合物109.6

13、mg/L(85.4mg/L～141.6mg/L)，殘殺威與雙酚A混合物1070.1mg/L(929.1mg/L～1244.2mg/L)。 1.23敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對脾淋巴細胞毒作用的聯合作用評價根據相加系數法的計算公式及判定標準，敵匹硫磷與雙酚A聯合暴露對小鼠脾淋巴細胞毒性表現為相加作用，殘殺威與雙酚A聯合暴露對小鼠脾淋巴細胞聯合毒性主要表現為相加作用。 2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨暴露和聯合暴露對RAW264

14、.7細胞和小鼠脾NK細胞免疫功能的影響2.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨及聯合暴露對RAW264.7細胞吞噬功能的影響2.1.1敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨及聯合暴露對RAW264.7細胞功能影響的劑量效應關系雙酚A(1.1×10-4mg/L～18mg/L)能增強RAW264.7吞噬熒光微球的能力，而敵匹硫磷(38.6mg/L～80.0mg/L)與殘殺威(35.6mg/L～120.0mg/L)則抑制RAW264.7的吞噬功能。

15、根據單獨暴露的IC50，將敵匹硫磷和雙酚A、殘殺威和雙酚A按等毒性比進行混合。敵匹硫磷和雙酚A混合物(62.5mg/L～90.0mg/L)、殘殺威和雙酚A混合物(25.7mg/L和130.0mg/L)對RAW264.7細胞吞噬能力均主要表現為抑制作用。 2.1.2敵匹硫磷、殘殺威和雙酚A對RAW264.7細胞吞噬功能影響的聯合作用評價60.0mg/L敵匹硫磷和12.0mg/L雙酚A、48.0mg/L殘殺威和4.0mg/L雙酚A對

16、PP和PI的影響均存在交互作用，且均為拮抗作用。 2.2敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨及聯合暴露對脾NK細胞免疫功能的影響2.2.1適宜效應細胞靶細胞比例(簡稱效靶比，E/T)的確定固定靶細胞(YAC-1細胞)的密度為1×105個/ml，依次改變小鼠脾淋巴細胞密度，獲得不同E/T值。同時接種相應不同密度的脾淋巴細胞，除了不加入YAC-1細胞外，其余同前。結果表明，100是最適宜本研究的E/T值。不同性別來源的NK細胞特異性殺傷活性

17、差異無顯著性(P<0.05)。 結論: 1.敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨與聯合暴露對巨噬細胞的毒作用大小順序為：雙酚A>敵匹硫磷>殘殺威，敵匹硫磷與雙酚A混合物>殘殺威與雙酚A混合物；敵匹硫磷、殘殺威與雙酚A單獨與聯合暴露對脾淋巴細胞的毒性大小順序為：敵匹硫磷>雙酚A>殘殺威，敵匹硫磷與雙酚A混合物>殘殺威與雙酚A混合。 2.在單獨暴露條件下，敵匹硫磷和殘殺威能抑制巨噬細胞的吞噬功能和NK細胞的殺傷活性；雙酚A則