1、目的：
　　 1.通過檢測VEGF在胃癌組織中的表達,以及不同濃度VEGF對AGS細胞增殖的影響,評價VEGF在胃癌增殖中的作用。
　　 2.通過檢測不同濃度VEGF對AGS細胞中MMP-9mRNA表達的影響,以及不同濃度VEGF對AGS細胞中MMP-9蛋白表達的影響,評價VEGF在MMP-9的表達中的作用。
　　 3.通過分析VEGF在胃癌增殖中的作用,以及VEGF在上調(diào)MMP-9的表達中的作用,探討VEGF和

2、MMP-9在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的相互作用,為研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制提供實驗依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1.標本來源:收集2007年8月至2009年5月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胃癌手術(shù)切除標本40例及癌旁組織10例作正常對照組。每個病例均經(jīng)手術(shù)和病理證實,且術(shù)前均未接受過放、化療。
　　 2.細胞培養(yǎng)及分組:胃癌細胞系A(chǔ)GS用含10％胎牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素各100U/m1)的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5

3、％CO2溫箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期AGS細胞,當細胞長至80％滿時,用0.25％胰蛋白酶消化,吸管反復(fù)吹打制成單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為2.5×105·mL-1,每孔200ul接種于96孔板,培養(yǎng)AGS細胞24 h。待細胞貼壁后,換成VEGF終濃度不同的培養(yǎng)液,共分為4組:正常對照組(含10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液)及培養(yǎng)液分別含10、30、及50 ng·ml-1 VEGF的濃度組,即A組、B組和C組,每組6孔。
　　

4、3.實驗方法:免疫組織化學(xué)染色,觀察胃癌組織及正常胃黏膜組織中VEGF的表達;MTT法,檢測不同濃度VEGF對胃癌AGS細胞增殖的影響;實時定量PCR,檢測不同濃度VEGF對AGS細胞中MMP-9mRNA表達的影響;Western blot,檢測不同濃度VEGF對AGS細胞中MMP-9蛋白表達的影響。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間陽性率及表達強度的比較采用Chi-square Test,必要時

5、用Fisher精確概率法。其余數(shù)據(jù)以均數(shù)+標準差表示,進行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.VEGF主要在癌細胞中呈陽性表達,在血管內(nèi)皮細胞及一些上皮細胞也有弱陽性表達,而正常組織無陽性表達。40例胃癌組織陽性率為85.0％,10例癌旁組織陽性率為40.0％,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.各實驗組AGS細胞隨著VEGF濃度的增加,增殖程度相應(yīng)增加;對照組、A組、

6、B組和C組的OD值經(jīng)方差分析后分別為0.225±0.015、0.263±0.019、0.324±0.020、0.352±0.020,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.各實驗組AGS細胞隨著VEGF濃度的增加,MMP-9mRNA表達量相應(yīng)增加;對照組、A組、B組和C組的相對熒光值分別為0.253±0.040、0.358±0.070、0.939±0.080、1.087±0.060,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　

7、　 4.各實驗組AGS細胞隨著VEGF濃度的增加,MMP-9蛋白表達量相應(yīng)增加,與MMP-9mRNA表達變化一致。
　　 結(jié)論
　　 1.本研究通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)VEGF在胃癌組織中高表達;通過MTT法證實VEGF能促進AGS細胞的增殖,綜合上述研究,可推斷VEGF參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 2.通過熒光定量PCR及Western blot檢測,我們發(fā)現(xiàn)VEGF明顯促進了AGS細胞MMP-9 mRNA及蛋白的