1、目的
　　惡性腫瘤嚴重危害人類健康和生存，是引起死亡的主要原因之一。阿霉素作為一種廣譜抗腫瘤藥物，在臨床上主要用于治療乳腺癌、兒童實體瘤、軟組織瘤、惡性淋巴癌等多種惡性腫瘤。長期應用易出現耐藥性并對正常組織器官，如心臟、腎臟、骨髓等具有明顯的毒副作用。本研究以阿霉素為研究對象，依據前體藥物的設計理念，選擇具有腫瘤靶向呈遞作用的大分子或小分子化合物，設計合成出一系列具有腫瘤靶向性的阿霉素前體藥物；通過核磁、質譜、紅外、液相色譜等手段

2、，確定其分子結構及其體外釋藥特性。利用腫瘤細胞體外實驗和荷瘤小鼠的體內實驗，結合阿霉素具有熒光的特點，采用熒光顯微鏡和流式細胞儀等檢測分析方法，觀察設計合成的目標化合物（阿霉素前體藥物）的腫瘤靶向性及體內、外抗腫瘤效應；通過HPLC-MS-MS方法，考察前體藥物的藥代動力學及組織分布特性；為增強阿霉素的療效，降低其毒副作用提供一定的實驗依據和理論基礎，為研發(fā)新型阿霉素抗腫瘤制劑開辟新的思路。
　　方法
　　合成一系列阿霉素前

3、體藥物，在氮氣保護下進行化學反應，反應過程及產物均用TLC監(jiān)控，點硅膠板在紫外燈下觀察反應進度及產物純度。通過高錳酸鉀將聚乙二醇6000（PEG）氧化成聚乙二醇6000二酸(中間產物2)；通過EDCI或DCC/DMAP的催化，將α－亞麻酸（LNA）或聚乙二醇6000二酸引入阿霉素（DOX）的3，-位氨基得到阿霉素和PEG或LNA的酰胺鍵連接物(PEG-DOXamidandDOX-LNA；即目標化合物1和3)。通過EDCI的催化，聚乙二醇

4、6000二酸與肼基甲酸叔丁酯(BOC肼)反應生成聚乙二醇6000二酰肼(BOC保護)(中間產物4)，去除BOC保護得到聚乙二醇6000二酰肼(中間產物5)；通過EDCI的催化，將聚乙二醇6000二酰肼引入阿霉素（DOX）的13-位羰基得到阿霉素和PEG的腙鍵連接物(PEG-DOXhydrazone；即目標化合物6)；利用熔點儀檢測目標化合物熔點，并分別進行1HNMR、MS、HPLC、IR等鑒定，以確定是否得到目標化合物。建立液相色譜條件

5、，在選定的水解條件下將前藥完全水解并對其進行定量分析，測定阿霉素－PEG連接前體藥物的載藥量，同時觀察阿霉素前體藥物在體外的釋藥性能。
　　培養(yǎng)HepG-2(肝癌)、MCF-7和MDA-MB-231(乳腺癌)細胞株，將待測的各種藥物（DOX、DOX-LNA、PEG-DOXamid、PEG-DOXhydrazone）按設定濃度分別與上述細胞孵育一定的時間，結合阿霉素具有熒光的特點，利用熒光顯微鏡觀察藥物在細胞內的分布，同時通過流式細

6、胞儀半定量分析細胞對藥物攝取的特點，并建立生物樣品中HPLC-MS-MS檢測阿霉素的方法，測定不同的腫瘤細胞對不同的前體藥物攝取的差別。采用MTT法，結合細胞生長抑制率的公式，計算不同的藥物對所選定的幾種腫瘤細胞的半數抑制率(IC50)，從而評價所設計合成的幾種前藥與阿霉素體外抗腫瘤活性的差別。采用透射電子顯微鏡，觀察不同藥物誘導細胞凋亡后細胞形態(tài)學的變化，評價前藥及阿霉素誘導腫瘤細胞凋亡的活性。將培養(yǎng)至對數生長期的MDA-MB-231

7、細胞接種于裸鼠腋下，建立荷瘤動物模型，分別設立DOX陽性藥組、DOX-LNA和PEG-DOXhydrazone兩種前體藥物的大、中、小劑量和化學預防組，給予相應的處理，每天觀察裸鼠的體重變化及腫瘤生長情況，根據公式計算腫瘤體積；試驗結束后，處死動物，取下腫瘤組織稱重，根據公式計算腫瘤生長抑制率，同時計算裸鼠存活時間和存活數，從而評價我們所設計合成的阿霉素前體藥物的體外抗腫瘤活性；復制荷瘤裸鼠模型，設立DOX組、DOX-LNA和PEG-D

8、OXhydrazone兩種前體藥物組，給予藥物后于2，8，24h處死動物，分別檢測藥物在腫瘤組織和正常組織中的含量，評價前體藥物的腫瘤靶向性。
　　SD大鼠靜脈給予DOX，DOX-LNA，PEG-DOXamid，PEG-DOXhydrazone5mg/kg，0.08、0.17、0.5、1、2、4、8、12、24h后乙醚麻醉大鼠，腹靜脈采集血樣（肝素抗凝），3000rpm離心10min，分離血漿；并于給藥0.5、2、8、24h后處死

9、動物，取心，肝，脾，肺，腎組織，稱重，勻漿備用。通過高效液相色譜-質譜連用（HPLC-MS-MS）方法，采用電噴霧電離負離子模式(ESI-)，多反應監(jiān)測(MRM)方式檢測靜脈給予阿霉素或其前藥后，大鼠血漿和組織中阿霉素濃度隨時間變化的規(guī)律，計算并分析上述藥物在大鼠體內代謝的藥物動力學參數。
　　結果
　　按照預先設計的路線，我們成功合成了3個阿霉素前體藥物，其中目標化合物1為暗紅色粉末，熔點91℃，產率為73％。核磁數據為δ

10、7.8(2H,d,CH-2andCH-4),7.4(1H,d,CH-3),5.50(1H,s,CH-1'),4.08(3H,s,H3C-O-C-1)，δ5.28-5.49(6H,m,CH-9,10,12,13,15and16),2.81-2.78(4H,m,CH2-11andCH2-14)。質譜測得準分子離子峰為m/z=802.8([M-H]-)，紅外結果顯示其結構與目標化合物一致；目標化合物3為暗紅色粉末，熔點82℃，產率為87％，阿

11、霉素載藥量為3.9％。核磁數據為δ7.8(2H,d,CH-2andCH-4),7.2(1H,d,CH-3),5.40(1H,s,CH-1'),4.10(3H,s,H3C-O-C-1)，δ3.61(PEG骨架)，紅外結果顯示其結構與目標化合物一致；目標化合物6為暗紅色粉末，熔點78℃，產率為82.5％，阿霉素載藥量為10.64％。核磁數據為δ7.1(2H,d,CH-2andCH-4),6.8(1H,d,CH-3),5.30(1H,s,CH

12、-1'),4.08(3H,s,H3C-O-C-1)，δ3.61(PEG骨架)，紅外結果顯示其結構與目標化合物一致。
　　建立了阿霉素的高效液相色譜檢測方法，在選定的色譜條件下，待檢測藥物阿霉素的色譜峰峰形好，不受雜質峰和溶劑峰的干擾，保留時間為3.79min，空白溶劑在該色譜條件下無特異吸收峰，色譜分析方法簡便可行，重復性好，穩(wěn)定可靠。線性范圍為0.5-100μg/mL，最低檢測限可達0.1μg/mL，日內，日間精密度(RSD)均

13、小于15％。阿霉素前體藥物體外釋藥研究結果顯示，PEG-DOXhydrazone具有酸敏性，在偏酸性環(huán)境下釋放較多，中性環(huán)境下較穩(wěn)定，而PEG-DOXamid不具有酸敏活性，在中性及酸性環(huán)境下釋藥性能均不如PEG-DOXhydrazone。
　　熒光顯微鏡結果表明，游離阿霉素與腫瘤細胞共孵育后僅有少量藥物進入細胞內，而阿霉素三種前體藥物在細胞內濃度均高于游離阿霉素，其中PEG-DOXamid在細胞內蓄積量最少，DOX-LNA和PE

14、G-DOXhydrazone在細胞內分布及蓄積量要高于PEG-DOXamid。細胞攝取實驗結果表明，與阿霉素相比，前體藥物進入細胞的量明顯增加，并具有一定的時間依賴性。其中HepG-2對藥物攝取量的峰值最高，MCF-7最低。大分子前藥與細胞分別孵育24、48、72h后，發(fā)現腫瘤細胞對大分子前藥的攝取呈現時間和劑量依賴性。MTT結果顯示，前藥對HepG-2、MCF-7、MDA-MB-231細胞均有一定的細胞毒性，且呈現良好的劑量依賴性。D

15、OX-LNA的IC50值低于阿霉素組，而PEG-DOXamid和PEG-DOXhydrazone的IC50值高于阿霉素組。此外，大分子前藥的體外細胞毒性還呈現出一定的時間依賴性，孵育時間越久，IC50值越低，抗腫瘤活性越好。透射電鏡結果顯示，前藥對HepG-2、MCF-7、MDA-MB-231細胞均有一定的誘導凋亡作用，其中DOX-LNA的誘導作用高于阿霉素組，而PEG-DOXamid和PEG-DOXhydrazone的活性則低于阿霉素

16、組。
　　成功建立了荷瘤裸鼠動物模型，實驗發(fā)現DOX-LNA和PEG-DOXhydrazone治療組動物體重變化與給藥劑量均呈反比，給藥劑量越大，動物體重增長越緩慢，而DOX-LNA和PEG-DOXhydrazone化學預防組動物體重增長較其治療組明顯。前藥能抑制腫瘤體積的增長，延長動物生存時間，呈現一定的抗腫瘤活性，且具有良好的劑量依賴性，其中化學預防處理組抗腫瘤活性好于治療組，DOX-LNA的抗腫瘤活性優(yōu)于PEG-DOXhyd

17、razone。靶向性實驗研究顯示，DOX-LNA和PEG-DOXhydrazone均能增加藥物在腫瘤組織的分布，降低阿霉素在正常組織尤其是心臟中的分布，具有一定的腫瘤靶向性，符合設計要求。
　　藥動學及組織分布實驗證實，前體藥物可延長阿霉素的半衰期，減少正常組織尤其是心臟中阿霉素的含量，其中PEG-DOXamid和PEG-DOXhydrazone具有一定的緩釋特性。
　　結論
　　設計合成了三個阿霉素前體藥物，通過核磁

18、，質譜，紅外等分析證實其結構符合設計目標。兩個大分子前藥能夠釋放出阿霉素，釋放速度緩和，釋放時間長。PEG-DOX腙鍵連接的前藥(化合物6)具有酸敏活性，達到預期設計目標。前體藥物可增加細胞對阿霉素的攝取，提高細胞內的藥物濃度。DOX-LNA的細胞毒性高于DOX，而PEG-DOXamid和PEG-DOXhydrazone的IC50高于原藥。前體藥物可誘導腫瘤細胞凋亡，影響細胞的生長調控。DOX-LNA和PEG-DOXhydrazone可